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濒危物种雅连及其不同炮制品对2型糖尿病大鼠的降糖调脂药效差异研究

分类:(二) 发表时间:2019-08-18

黄连为毛茛科植物黄连Coptis chiensis Franch.、三角叶黄连C.deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao或云连C.teeta Wall.的干燥根茎, 以上3种分别习称味连雅连云连, 其中雅连因对地理条件要求苛刻, 故为黄连中的
 
黄连为毛茛科植物黄连Coptis chiensis Franch.、三角叶黄连C.deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao或云连C.teeta Wall.的干燥根茎, 以上3种分别习称“味连”“雅连”“云连”, 其中雅连因对地理条件要求苛刻, 故为黄连中的珍品[1,2]。尽管黄连在止消渴方面的优势广为古代医者推崇, 但既往对黄连的研究大都集中于味连, 而对雅连研究偏少, 对于雅连炮制品降糖药效更无准确记载。四川洪雅、雅安、峨眉是中药雅连的主产区, 当地政府十分重视道地药材濒危物种的保护利用, 因此药材易于获得, 研究便于开展。本研究选择3种收载于《中国药典》2015年版的黄连炮制品, 重点考察雅连加工前后在降血糖及调节脂质紊乱方面的药效差异。该研究的开展, 可为加强黄连种质资源保护, 寻找雅连可持续开发与利用途径提供基础研究资料。
 
1 材料
 
1.1 药品与试剂
 
 
雅连药材 (四川省洪雅县瓦屋山药业有限公司) 经西南交通大学宋良科教授鉴定为毛茛科植物三角叶黄连C.deltoidea C.Y.Cheng et Hisao的干燥根茎;吴茱萸药材 (北京同仁堂大药房) 经西南交通大学宋良科教授鉴定为芸香科植物吴茱萸Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth的干燥近成熟果实;盐酸二甲双胍肠溶片 (贵州圣济堂制药有限公司, 批号20160242) ;链脲佐菌素 (STZ, Rolarbio®公司, 批号415G0316) ;大鼠血清胰岛素酶联免疫试剂盒 (Ex Cell Bio公司, 批号21G086) ;96T总胆固醇 (TC) 测试盒 (批号21070512) 、96T糖化血清蛋白测试盒 (批号21070605) 、96T三酰甘油 (TG) 测试盒 (批号21070513) 、96T高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-C) 测试盒 (批号21070512) 、96T低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C) 测试盒 (批号210700512) 均购于南京建成生物工程研究所;柠檬酸及柠檬酸钠 (分析纯, 成都化学试剂厂) ;总RNA抽提试剂 (美国Invitrogen公司, 批号16596-026) ;焦碳酸二乙酯 (美国Sigma, 批号D575810132) ;Prime Script RT reagent Kit (货号RR047A) 、SYBR Premix Ex Taq II Kit (货号RR820A) 购于大连宝生物工程有限公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒 (南京凯基生物公司, 批号KGP903) ;预染蛋白Marker (美国NEB公司, 批号00215343) ;ECL发光试剂盒 (美国Thermo公司, 批号BL520A) ;兔克隆抗体SCAP抗体 (英国Abcam-上海艾博抗贸易有限公司, 批号ab190103) ;SREBP-1C抗体 (兔克隆抗体, Affinity公司, 批号AF6283) ;鼠单克隆抗体β-actin抗体 (英国Abcam-上海艾博抗贸易有限公司, 批号ab8226) ;生物素化山羊抗鼠IgG (H+L) (英国Abcam-上海艾博抗贸易有限公司, 批号ab6789) ;生物素化山羊抗兔IgG (H+L) (英国Abcam-上海艾博抗贸易有限公司, 批号ab6721) 。
 
1.2 仪器
 
 
ACCU-CHEK®Active活力型罗氏血糖仪 (德国罗氏诊断有限公司) ;垂直电泳槽、DYY-6C电泳仪、UV Transilluminator化学发光凝胶成像仪、Image Lab凝胶分析系统 (美国Bio-RAD公司) ;TS-2水平脱色摇床 (海门Kylin-Bell仪器制造有限公司) ;TGL-16G-A高速低温离心机 (上海安亭科学仪器厂) ;ChemiDoc XRS+Systems凝胶扫描成像仪;MK3型全功能酶标仪、PIKORed 96实时荧光定量仪、TCA0096热循环仪 (美国ThermoFisher仪器有限公司) 。
 
1.3 动物
 
 
SPF级雄性SD大鼠 (6周龄) , 体质量180~200 g, 由四川省医学科学院动物研究所提供, 动物许可证号SCXK (川) 2013-15。
 
2 方法
 
2.1 雅连不同炮制品的制备
 
 
依照《中国药典》2010年版及本课题组前期实验研究结果[3]制备雅连的不同炮制品。
 
2.1.1 酒炙雅连
 
 
取净雅连, 加黄酒拌匀 (100 g雅连用黄酒12.5 g) , 闷润2 h, 置炒制容器内, 文火100℃清炒12.5 min, 取出, 放凉。成品色泽加深且略有酒香气。
 
2.1.2 姜炙雅连
 
 
将生姜洗净, 捣烂, 加水适量, 压榨取汁, 姜渣再加水适量重复压榨1次, 合并汁液, 即为姜汁, 姜汁与生姜的比例为1∶1。取净雅连, 加姜汁拌匀 (100 g雅连用生姜12.5 g) , 闷润3h, 130℃清炒5 min取出, 晾干。成品表面棕黄色, 有姜的辛辣味。
 
2.1.3 萸炙雅连:
 
 
取吴茱萸加适量水煎煮, 煎液与净雅连拌匀 (100 g雅连用吴茱萸10 g) , 闷润1 h, 160℃清炒5 min, 待液吸尽, 炒干。成品表面棕黄色, 有吴茱萸的辛辣香气。
 
2.2 雅连生品及不同炮制品水煎液的制备
 
 
称取适量药材, 加水浸泡30 min, 小火煎煮至沸, 滤过, 药渣再加水适量继续煎煮, 合并2次滤液, 浓缩至适当体积, 使水煎液生药质量浓度为1.58g/mL。
 
2.3 2型糖尿病大鼠模型制备[4]
 
 
实验条件下, 所有动物适应性喂养3 d, 随机取出10只作为对照组, 给予基础饲料正常喂养。其余72只大鼠均以高糖高脂饲料 (20%蔗糖、10%猪油、2.5%胆固醇、1%胆酸钠、66.5%基础饲料) 进行饮食诱导, 4周后, 禁食不禁水12 h, 而大鼠ip给予32.5 mg/kg STZ, 药物诱导72 h后禁食不禁水6~8h, 取尾尖静脉血测血糖, 以空腹血糖 (FBG) 值≥11.1 mmol/L视为模型成功[5]。
 
2.4 动物分组及给药
 
 
将造模成功大鼠随机分为模型组、阳性药二甲双胍组、雅连生品组、姜炙雅连组、酒炙雅连组、萸炙雅连组 (每组12只) 。对照组及模型组大鼠均ig生理盐水;二甲双胍组ig 200 mg/kg二甲双胍溶液;雅连生品组、姜炙雅连组、酒炙雅连组、萸炙雅连组大鼠分别ig给予相应的水煎液7.88 g/kg (生药剂量, 黄连用于降血糖的人体常用剂量为生药30~45 g/d, 本实验按平均值37.5 g/d, 首先折算成大鼠等效剂量, 该剂量2倍即为本实验中雅连各组的生药剂量) , 给药体积为5 mL/kg, 每天1次, 连续给药30 d。
 
2.5 血糖相关指标检测
 
2.5.1 FBG检测
 
 
于给药第0、30天, 各组动物禁食不禁水6~8 h, 取尾尖静脉血, 采用罗氏血糖仪测定FBG水平。
 
2.5.2 空腹血清胰岛素 (FINS) 、糖化血清蛋白 (GSP) 检测
 
 
给药30 d后, 所有大鼠禁食12 h, 采用7%水合氯醛 (3.5 m L/kg) ip实施浅麻醉, 股动脉采血, 室温静置20 min后, 4℃、3 000 r/min离心10 min, 取上清, 严格按照试剂盒说明采用ELISA法测定FINS, 果糖胺法测定GSP水平。
 
2.6 血脂相关指标检测
 
2.6.1 血清TG、TC、HDL-C、LDL-C检测
 
 
依照“2.5.2”项方法取各组动物血清, 严格按试剂盒说明测定血清TG、TC、HDL-C、LDL-C水平。
 
2.6.2 肝组织SCAP、SREBP-1c蛋白表达检测
 
 
取液氮冻存的各组大鼠肝脏样本, 37℃水浴解冻, 加入RIPA裂解液裂解10 min, 4℃、12 000 r/min离心10 min, 取上清液, 采用BCA蛋白法测定蛋白质量浓度;各组吸取80μL, 按4∶1比例加入5×Loding buffer, 混匀后95℃热循环15 min;根据目的蛋白相对分子质量配制分离胶和浓缩胶, 各种蛋白分别加样, 进行PAGE-SDS电泳;之后将凝胶上的蛋白电转移至PVDF膜上, 根据目的蛋白位置留取所需PVDF膜, 用含5%BSA的TBST缓冲液封闭;分别向PVDF膜中加入相应的一抗 (SCAP1∶1 000、SREBP-1C 1∶1 000、β-actin 1∶5 000) , 4℃孵育24 h。次日, 用TBST洗膜, 二抗 (1∶5 000) 室温孵育2~3 h, 洗膜;用凝胶图像分析成像系统进行扫描分析, 结果以目的蛋白相对表达量 (目的蛋白积分吸光度值/内参积分吸光度值) 表示。
 
2.6.3 肝组织SCAP、SREBP-1c m RNA表达检测
 
 
参照Trizol试剂盒说明检测大鼠肝脏组织总RNA, A260/A280鉴定RNA纯度, 取A260/A280>1.8的样品;变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA有无降解。RT-PCR反应按照试剂盒说明加样, 按照95℃预变性30 s, 95℃变性5 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 40个循环的反应条件, 在PCR仪进行逆转录后, 再取反应产物进行琼脂糖凝胶电泳, 得出特异性基因相对与内参基因的相对表达量。引物序列如下:β-actin上游引物5’-GAAGATCAAGATCATTGC-TCCT-3’, 下游引物5’-TACTCCTGCTTGCTGA-TCC-3’;SCAP上游引物5’-ATTGCTCTAGTGCTG-CTGCTGCTCTG-3’, 下游引物5’-TATCTCCGTC-TCAGGCGGTGCGTAG-3’;SREBP-1C上游引物5’-TGGCAGTGGAGGAGGCACAGATGT-3’, 下游引物5’-CCGCTGGGCTTTCACCTGGTTATCC-3’。
 
2.7 统计学分析
 
 
采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析, 数据以表示, 多样本均数间比较采用One-Way ANOVA检验, 方差齐则采用LSD检验, 方差不齐则采用Tamhane’s T2检验。
 
3 结果
 
3.1 对血糖相关指标的影响
 
 
连续给药30 d后, 各组大鼠FINS、GSP及给药前后FBG变化见表1。与对照组相比, 模型组大鼠FINS显著降低 (P<0.01) , 而FBG (第0天和第30天FBG基本持平) 显著升高 (P<0.01) , GSP显著增加 (P<0.01) , 表明模型组大鼠在接受高糖高脂饮食合并STZ攻击后, 胰腺β细胞分泌不足导致机体FINS降低, FBG及GSP维持高水平状态。与模型组相比, 二甲双胍及雅连各给药组大鼠FINS均有不同程度升高, 表明各药物对机体FINS水平均有一定恢复作用;各给药组大鼠FBG、GSP水平均有不同程度下降, 且变化较为显著 (P<0.05、0.01) , 比较酒炙雅连、姜炙雅连、萸炙雅连的降糖疗效, 以酒炙雅连作用最为明显 (FBG水平降低幅度最大) 。
 
3.2 对血脂相关指标的影响
 
 
连续给药30 d后, 各组大鼠空腹血清TG、TC、HDL-C、LDL-C水平测定结果见表2。与对照组相比, 模型组大鼠血清TG、TC、LDL-C水平均显著升高 (P<0.01) , 而HDL-C水平显著降低 (P<0.01) , 表明2型糖尿病大鼠机体发生脂质代谢障碍。与模型组相比, 二甲双胍及雅连各给药组大鼠血清TG、TC、LDL-C水平均有不同程度下降 (P<0.05、0.01) , 而HDL-C水平显著升高 (P<0.05、0.01) , 从变化幅度上来看, 酒炙和萸炙雅连的调脂效果稍强一些。
 
 
表1 雅连及其不同炮制品对2型糖尿病大鼠FINS、FBG和GSP的影响Table 1 Effect of C.deltoidea and its processed products on levels of FINS, FBG, and GSP of T2DM rats     下载原表 
表1 雅连及其不同炮制品对2型糖尿病大鼠FINS、FBG和GSP的影响Table 1 Effect of C.deltoidea and its processed products on levels of FINS, FBG, and GSP of T2DM rats  
与对照组比较:**P<0.01;与模型组比较:△P<0.05△△P<0.01, 下同**P<0.01 vs control group;△P<0.05△△P<0.01 vs model group, same as below
 
 
表2 雅连及其不同炮制品对2型糖尿病大鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C的影响Table 2 Effect of C.deltoidea and its processed products on TG, TC, HDL-C, and LDL-C in serum of T2DM rats     下载原表 
表2 雅连及其不同炮制品对2型糖尿病大鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C的影响Table 2 Effect of C.deltoidea and its processed products on TG, TC, HDL-C, and LDL-C in serum of T2DM rats  
 
连续给药30 d后, 各组大鼠肝脏SCAP、SREBP-1c蛋白及m RNA表达测定结果见表3和图1。与对照组相比, 模型组大鼠肝脏中SCAP、SREBP-1c蛋白及m RNA呈显著高表达状态 (P<0.01) , 雅连及其3种炮制品均能够下调上述基因蛋白及m RNA的表达 (P<0.05、0.01) , 且与阳性药物二甲双胍趋势一致。从3种炮制品的具体数据来看, 酒炙及萸炙雅连下调SCAP、SREBP-1c蛋白及m RNA表达的作用更为显著。
 
4 讨论
 
 
关于中药黄连治消渴的研究已经较为透彻, 但这些研究多聚焦于黄连习用品味连, 而对黄连中的珍品雅连研究甚少。课题组前期针对血糖、血脂几项常规指标, 将味连与黄连濒危物种雅连进行了系统对比, 发现两者在降糖方面并无显著性差异, 但在调脂方面, 雅连生品降低血清TG水平及下调胰岛素靶器官肝脏的固醇调节通路关键蛋白及基因的作用明显优于味连生品[6,7]。如若选用辛温热之品 (生姜、黄酒或吴茱萸) 对雅连进行炮制加工, 能够很大程度地抑制黄连苦寒之性[8], 但这些传统加工是否会对雅连降糖、调脂药效产生影响, 是本研究主要探讨的科学问题。
 
 
表3 雅连及其不同炮制品对2型糖尿病大鼠肝脏中SCAP、SREBP-1c蛋白及m RNA表达的影响Table 3 Effect of C.deltoidea and its processed products on protein and m RNA expression of SCAP, SREBP-1c in liver of T2DM rats     下载原表 
表3 雅连及其不同炮制品对2型糖尿病大鼠肝脏中SCAP、SREBP-1c蛋白及m RNA表达的影响Table 3 Effect of C.deltoidea and its processed products on protein and m RNA expression of SCAP, SREBP-1c in liver of T2DM rats  
图1 各组大鼠肝脏中SCAP、SREBP-1c蛋白表达Fig.1 Protein expression of SCAP and SREBP-1c in liver of rats in each group  
图1 各组大鼠肝脏中SCAP、SREBP-1c蛋白表达Fig.1 Protein expression of SCAP and SREBP-1c in liver of rats in each group   下载原图
 
 
 
通过本实验对雅连常用炮制品的药效比较分析, 发现雅连酒炙品和萸炙品降糖作用较好, 其中酒炙品的降糖幅度更大, 其原因可能是雅连经黄酒闷润和加热使药材饮片膨胀促进细胞通透性, 吴茱萸中的有机酸可与雅连中的生物碱成分结合, 而使生物碱溶出度有所增加[9]。
 
 
有研究表明, 胰岛素抵抗是2型糖尿病的特征之一, 由于脂肪细胞对胰岛素的抵抗作用, 使胰岛素的脂肪分解效应受到抑制, 游离脂肪酸生成增多, 进入肝脏, 导致三酰甘油生成增加[10,11]。本研究也证实了模型大鼠与正常大鼠相比, 机体TG、TC及LDL-C明显呈现高水平状态, 研究涉及的3种雅连炮制品均能不同程度地改善2型糖尿病大鼠机体脂质紊乱现象, 但酒炙及萸炙品效果更为突出, 其调脂机制可能与下调胰岛素靶器官SCAP、SREBP-1c蛋白及m RNA表达有关。
 
 
从本研究总体结果来看, 萸炙雅连显示出较好的应用前景, 据研究分析, 黄连与吴茱萸配伍后, 并无新化合物产生[12], 究竟是哪种化学成分起到降糖、调脂作用有待于后续进行更为深入的研究。
 

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文章名称:濒危物种雅连及其不同炮制品对2型糖尿病大鼠的降糖调脂药效差异研究

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