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广金钱草挥发油基于TRP通道的抗炎作用研究

分类:(二) 发表时间:2019-08-18

挥发油是中药活性成分之一, 也称为芳香油或精油, 具有广泛的药理作用, 发挥化湿、解表和行气等功效, 可以预防局部或全身疾病。目前, 国内外学者已对中药挥发油的提取及抗菌、抗氧
 
挥发油是中药活性成分之一, 也称为芳香油或精油, 具有广泛的药理作用, 发挥化湿、解表和行气等功效, 可以预防局部或全身疾病。目前, 国内外学者已对中药挥发油的提取及抗菌、抗氧化、抗肿瘤等作用进行深入研究, 并取得了显著的成果[1]。中药挥发油化学成分非常复杂, 在疾病中共同发挥作用, 导致结果或机制的复杂性。因此, 一些简单的药理学方法不能系统地揭示中药挥发油化学成分在体内的作用机制。目前, 科学技术的不断发展、多学科的相互交叉为挥发油药效的评价提供了高效、快速的方法[2]。靶点筛选借助计算机模拟分析、生物信息学和分子网络数据等, 从不同角度预测药物发挥药效的作用机制, 成为药效评价体系不可缺少的一部分[3]。利用计算机辅助药物平台可以评价挥发油的药效, 预测发挥药理作用的靶标蛋白 (基因) , 整体、系统、全面地研究挥发油-靶标-通路-疾病之间的关联性, 为挥发油的药理作用及产品开发等提供理论依据和技术支撑。
 
 
广金钱草Desmodium styracifolium (Osb.) Merr.为临床常用中药材, 又名金钱草、马蹄草、马蹄香等, 以“马蹄草”记载于《岭南采药录》, 为豆科植物广金钱草的干燥地上部分[4], 不仅可以药用, 还可以食用。广金钱草广泛分布在我国广东、广西、福建等地, 在越南、缅甸、印度等国家也有分布。其药理作用有抗炎、抗氧化、保肝利胆等, 民间广泛用于治疗肝、肾、胆结石, 临床上主要用于治疗泌尿系统结石。广金钱草的主要化学成分为生物碱类、萜类、黄酮类、挥发油和甾醇类等[5]。有关广金钱草挥发油抗炎作用的分子机制研究较少[6], 因此本研究采用水蒸气蒸馏法提取广金钱草中的挥发油, 通过气相色谱-质谱 (GC-MS) 联用技术鉴定其化学成分, 用峰面积归一化法测定其化学成分的相对质量分数。借助在线软件预测广金钱草挥发油化学成分的靶标蛋白, 对靶标蛋白进行通路及蛋白相互作用分析, 采用分子对接技术将其小分子和瞬时受体电位 (TRP) 通道靶标蛋白进行能量匹配, 为其挥发油的开发和应用提供理论依据。
 
1 材料与仪器
 
 
广金钱草采自广西南宁, 经贵阳中医学院药学院周静教授奠定为豆科植物广金钱草Desmodium styracifolium (Osb.) Merr.的干燥地上部分, 密封室温放置于样本室, 编号为201811005, 备用。
 
 
KDM-2000电热套 (江苏杰瑞尔电器有限公司) ;Agilent 6890/5975C气质 (GC-MS) 联用仪 (美国Agilent公司) ;UX2200H电子天平 (精度0.01 g, 日本岛津公司) ;挥发油提取器 (厦门海标科技有限公司) ;LK-400A摇摆式中药粉碎机 (上海隆拓仪器设备有限公司) ;正己烷、无水Na2SO4均为国产分析纯。
 
2 方法
 
2.1 广金钱草挥发油的提取
 
 
参照《中国药典》2015年版水蒸气蒸馏法提取, 取干燥的广金钱草100 g, 粉碎, 过3号筛 (50目) , 并混合均匀[7]。置于2 L圆底烧瓶中, 加入1 L蒸馏水浸泡过夜, 加正己烷1 mL, 连续提取5 h, 用旋转蒸发仪回收正己烷, 得到具有芳香气味的透明油状液体2.2 m L, 可能含有极少量正己烷, GC-MS检测可以忽略, 经无水Na2SO4干燥, 终产物置于4℃的低温冰箱中冷藏备用。
 
2.2 GC-MS条件
 
 
广金钱草挥发油样品采用GC-MS联用仪进行分析, 色谱柱为FB-5MSI (30 m×0.25 mm, 0.25μm) 弹性石英毛细管柱, 初始温度48℃ (保留2 min) , 以4℃/min升温至220℃, 再以15℃/min升温至310℃, 保留5 min, 运行时间56 min;汽化室温度250℃;柱前压52 kPa, 载气流量1.0 mL/min, 分流, 分流比20∶1, 溶剂延迟时间5.0 min。离子源 (EI) 温度230℃;四极杆温度150℃;射电流34.6μA;电子能量70 eV;发倍增器电压1 659V;接口温度280℃;质量范围m/z 29~450。
 
2.3 小分子的优化处理
 
 
通过中药系统药理学数据库和分析平台 (Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology, TCMSP) 下载广金钱草小分子的mol2结构, 基于SYBYL 2.1 (Tripos) 对广金钱草小分子加氢和加电荷[8], 每个分子进行Minimize能量优化及加氢处理, 优化参数为:优化次数10 000, 能量收敛标准0.000 5kcal/ (mol·nm) , 选择Tripos标准分子力场和添加Gasteiger-Hückel电荷, 基于Powell能量梯度法优化得到最低能量构象, 进行能量优化的目的是寻找配体分子的最低能量构象以模仿自然体系中的分子稳定构象, 保存为SLN格式。
 
2.4 靶标蛋白筛选
 
 
Swiss ADME (http://www.swissadme) 具有多个模块, 本研究采用Swiss Target Prediction (http://www.swisstargetprediction.ch/) [9]模块, 该模块能根据化学成分的2D和3D结构精确预测生物活性分子靶点。通过Swiss Target Prediction进行靶标预测, 输入主要化学成分的简化分子线性输入规范 (simplified molecular input line entry specification, SMILES) , Organism选择Homo Sapiens, 每个化学成分通过ChemAxon molconvert工具生成20种不同构象, 每个构象有18维特征向量, 根据曼哈顿距离和logistic回归模型进行评分。系统默认每个化学成分输出15个靶标蛋白, 包括蛋白名称、基因名称、Uniprot ID等信息。
 
2.5 通路分析
 
 
靶标通路分析基于KOBAS (KEGG orthology based annotation system) 在线分析 (http://kobas.cbi.pku.edu.cn/) [10], 通过KOBAS软件的ID映射 (ID Mapping) 功能模块, 将检索的基因ID通过Blast或直接映射到相应的基因名称, 这些基因通过数据库富集到相应的通路 (pathway) 、GO (Gene Ontology) 功能、疾病 (disease) 。在基因列表中输入基因ID, 物种选择:人源 (homo sapiens) , 选择KEGG pathway, 在线分析完成, 输出结果。得到靶标蛋白所参与的所有途径, 筛选出靶标蛋白显著参与的途径 (P≤0.01) , 通过Rstudio中的ggplot2绘制前10条通路, 包括通路名称、富集因子、富集分析的P值和Q值等。富集因子通过计算所得, 数值越大表示富集程度越大。
 
2.6 分子对接
 
 
采用药物分子设计模拟SYBYL 2.1软件的Surflex-Dock模块完成分子对接研究[11]。基于RCSB Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb) [12,13,14,15,16]下载transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 (TPRV1, PDBID:2PNN) 、Transient receptor potential cation channel subfamily V member 4 (TPRV4, PDBID:4DX1) 、transient receptor potential cation channel subfamily V member2 (TPRV2, PDBID:2F37) 、protein kinase C gamma (PRKCG, PDBID:2E73) 、protein kinase C beta (PRKCB, PDBID:1A25) 、protein kinase C alpha (PRKCA, PDBID:4DNL) 、protein kinase C theta (PRKCQ, PDBID:2ENJ) 、protein kinase C delta type regulatory subunit (PRKCD, PDBID:1YRK) 、protein kinase C eta (PRKCH, PDBID:3THO) 和protein kinase C epsilon (PRKCE, PDBID:1GMI) 的晶体结构。选用AMBER7 FF99力场进行能量优化;选择Automatic模式产生活性口袋, 优化完毕后保存为SFXC文件作为对接文件, 其他所有参数均采用Sybyl默认值。利用Surflex-Dock分子对接模块的Total-Score打分函数对小分子与靶标相互作用进行评分, 综合考虑了极性作用、疏水作用、焓和溶剂化等因素, 该值越大, 表明对接复合物越稳定, 小分子化合物与大分子蛋白的匹配结合作用越好。Total-Score大于5.0表明小分子与靶点有较好的结合活性, 大于7.0表明分子与靶点的结合构型具有强烈的活性。
 
2.7 相互作用分析
 
 
Ligplot作为经典的配体与蛋白二维相互作用作图软件, 应用较广泛, 氢键和疏水作用基于HBPLUS程序计算, 以2D的形式展示结构, 方便观察。本研究基于Ligplot 1.4.5版本, 将挥发油关键化学成分与靶标蛋白merg以PDB格式保存, 导入Ligplot软件中, 自动计算形成的氢键、疏水作用和结构比对。
 
3 结果
 
3.1 挥发油化学成分
 
 
通过GC-MS联用仪对总离子流图中的各峰经质谱计算机数据系统检索及核对Wiley275和Nist2005标准质谱图, 鉴定出其中的特征成分, 以面积归一化法计算广金钱草挥发油各组分的相对含量, 得到其总离子流图 (图1) , 确定了33种挥发性化学成分 (表1) 。本实验由于柱温升高速率较快 (缩短检测时间) , 导致背景偏高, 呈现出基线上移状态, 但是进行检索时已经扣除峰谷背景, 上移未对数据检索带来过多干扰。
 
 
广金钱草挥发油中共鉴定出33个化合物, 占挥发油总量的90.1%, 质量分数较高的为六氢法尼基丙酮、二十二烷、二十三烷、二十四烷、二十五烷、二十六烷、二十七烷等17个化学成分 (质量分数>1%) , 占挥发油总量的86.436%, 作为分子对接的配体库。
 
3.2 通路分析
 
 
借助Swiss Target Prediction筛选广金钱草挥发油主要化学成分的靶标蛋白。Swiss Target Prediction系统默认每个化学成分输出15个靶标蛋白, 17个化学成分共筛选出255个, 去除重复出现的靶标蛋白, 共筛选出88个靶标蛋白, 参与110条代谢途径。采用Rstudio的ggplot2输出前10条显著通路 (图2) 。10条通路中包括inflammatory mediator regulation of TRP channels (P值=1.26×10-10) 。
 
图1 挥发油成分总离子流图Fig.1 Total ion current chromatogram of component of volatile oils  
图1 挥发油成分总离子流图Fig.1 Total ion current chromatogram of component of volatile oils   下载原图
 
 
3.3 分子对接
 
 
TRP通路包括11个潜在靶标, 其中Bradykinin receptor B1 (BDKRB1) 没有原配体, 将不深入研究, 将小分子与TRP通路中的10个靶标蛋白进行能量匹配, 筛选重要的抗炎靶标蛋白 (表2) 。Surflex-Dock具有速度快、准确性高, 对接结果以Total Score、C-Score、D-Score、Crash和Polar等参数值输出, 配体与受体结合稳定性以Total-Score值的大小来评价, 以Total-Score等于或大于5为阈值, 挑选对接效果好的化合物。
 
3.4 化学成分-靶标网络模型构建
 
 
化学成分-靶标网络模型基于开源的复杂网络分析与可视化平台Cytoscape 3.5.1进行绘制[17], 根据度 (degree) 的大小筛选关键靶点及化学成分, 整个网络包括化学成分和靶标2类节点 (node) , 分别计算网络每个节点的度, 整个网络中节点的大小与此节点的度呈正比, 即与此节点相连的边越多, 度越大, 节点也就越大。结果表明叶绿醇、三十一烷、法尼基丙酮、角鲨烯、2-硬脂酸单甘油酯和1-棕榈酸单甘油酯为广金钱草挥发油发挥抗炎的关键化学成分, 分子对接总分大于50。TPRV1 (transient receptor potential cation channel, subfamily V, member 1) 、PKCB (protein kinase C, beta) 和PKCD (protein kinase C, delta) 为广金钱草挥发油调节的关键靶标蛋白 (degree>10) , 分子对接总分大于90 (图3) 。
 
3.5 相互作用分析
 
 
基于Ligplot 1.4.5软件对广金钱草挥发油关键化学成分 (Total-Score>50) 和TPRV1、PRKCD的相互作用进行分析, 结果以氢键、疏水作用和结构比对输出, 筛选关键的氨基酸位点。结构比对结果见表3、4, 叶绿醇、三十一烷、法尼基丙酮、角鲨烯、2-硬脂酸单甘油酯和1-棕榈酸单甘油酯与TPRV1相互作用有很大的相似性, 结构比对中可以看出Lys155、Tyr194、Leu163、Tyr199等氨基酸残基相对位置相同, 氨基酸类型相同 (表3) ;同样这些化合物与PRKCD的相互作用有很大的相似性, 结构比对中可以看出Ala61、Asp60、Try64、Glu23、Gln8等氨基酸残基相对位置相同, 氨基酸类型相同 (表4) 。可以推测这些残基就是TPRV1和PRKCD的重要残基, 其在决定酶的催化特性中起到了重要作用。
 
4 讨论
 
 
炎症在多种疾病中扮演重要角色, 主要指机体组织损伤或病原体感染时产生的复杂反应, 导致各种炎性疾病。TRP通道是一类离子通道, 可以被热激活, TRPV1~4为典型的热敏瞬时受体电位通道[18]。炎症疾病的发生导致TRP离子通道的功能失调, 因此TRP通道成为关键的药物作用靶点, 受到广泛的关注。蛋白激酶C分布于机体各种细胞中, 对突触传递有一定的影响, 可通过磷酸化调节蛋白的活性, 逐级磷酸化, 放大信号, 导致细胞反应[19]。蛋白水解酶激活蛋白激酶C可以增强瞬时感受器电位香草素受体1 (TRPV1) 的敏感性。神经递质、生长因子和肽类物质等多种炎症介质可以激活TPRV1[20], 在炎症和疼痛中发挥重要作用[21]。TRPV2与TPRV1有50%的同源性, 与炎症引起的痛觉增敏可能相关[22]。TRPV4可以被多种理化刺激激活, 在心血管、消化系统、呼吸系统等广泛表达, 参与疾病的发生、发展[23]。总之, TPR通道在炎症和疼痛中具有重要作用, 以拮抗TPRV1、TPRV2和TPRV4靶点的表达开展挥发油抗炎研究, 有望为挥发油抗炎作用寻找新的切入点。
 
 
表1 广金钱草挥发油中的化学成分Table 1 Chemical composition in volatile oils of D.styracifolium     下载原表 
表1 广金钱草挥发油中的化学成分Table 1 Chemical composition in volatile oils of D.styracifolium  
图2 靶标蛋白通路分析Fig.2 Analysis of target protein pathway  
图2 靶标蛋白通路分析Fig.2 Analysis of target protein pathway   下载原图
 
 
 
表2 活性成分与靶标蛋白分子对接Table 2 Docking of active components with target protein molecules     下载原表 
表2 活性成分与靶标蛋白分子对接Table 2 Docking of active components with target protein molecules  
—1-三十烷与蛋白激酶Cδ (PRKCD) 没有结合;—2-化合物或蛋白未进行加合分析—1-triacontane does not bind to protein kinase C delta (PRKCD) ;—2-no additive analysis of compounds or proteins
 
图3 化学成分-靶标网络模型Fig.3 Chemical composition-target network model  
图3 化学成分-靶标网络模型Fig.3 Chemical composition-target network model   下载原图
 
 
 
表3 关键化学成分与TPRV1形成的氢键及疏水作用Table 3 Hydrogen bond and hydrophobic action between key chemical components and TPRV1     下载原表 
表3 关键化学成分与TPRV1形成的氢键及疏水作用Table 3 Hydrogen bond and hydrophobic action between key chemical components and TPRV1  
 
表4 关键化学成分与PRKCD形成的氢键及疏水作用Table 4 Hydrogen bond and hydrophobic action between key chemical components and PRKCD     下载原表 
表4 关键化学成分与PRKCD形成的氢键及疏水作用Table 4 Hydrogen bond and hydrophobic action between key chemical components and PRKCD  
 
广金钱草为民间常用中药材, 药理作用多样, 但对其挥发性物质的研究较少, 尤其抗炎分子机制研究尚未明确[24]。挥发油能被机体快速吸收, 药理作用主要集中在抗炎、抗氧化、抗肿瘤等。本研究筛选出广金钱草挥发油发挥抗炎的关键成分及靶点, 通过相互作用进一步明确重要的氨基酸残基。结果表明, 广金钱草挥发油与PRKCB、TPRV1和PRKCD有较强的结合, 这可能是其发挥抗炎作用的主要分子机制。基于计算机辅助平台建立挥发油药理作用靶点快速筛选方法, 为挥发油药效评价提供新思路, 同时为挥发油动物和细胞实验研究提供理论支撑。
 

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文章名称:广金钱草挥发油基于TRP通道的抗炎作用研究

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