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基于网络药理学的牛膝防治阿尔茨海默病的物质基础与作用机制研究

分类:(二) 发表时间:2019-08-18

阿尔茨海默病 (Alzheimers disease, AD) 是一种以认知、行为功能障碍为主要表现的神经系统退行性病变[1]。其病因尚不明确, 病机假说有多种, 如胆碱能系统功能障碍、A毒性学说、Tau蛋白磷酸
 
阿尔茨海默病 (Alzheimer’s disease, AD) 是一种以认知、行为功能障碍为主要表现的神经系统退行性病变[1]。其病因尚不明确, 病机假说有多种, 如胆碱能系统功能障碍、Aβ毒性学说、Tau蛋白磷酸化学说、血清素激活的系统功能障碍、氧化应激学说、细胞凋亡学说等[2]。目前, 针对其机制假说, 临床多以“单靶标”药物治疗AD, 如乙酰胆碱酯酶 (ACh E) 抑制剂多奈哌齐、加兰他敏等, N-甲基-D-天冬氨酸 (NMDA) 受体拮抗药美金刚, 但治疗效果不理想。中药及复方含有大量的化学物质, 可作用于疾病相关的多个靶点, 对于AD这种多因素、复杂性疾病的治疗具有优势。牛膝属于苋科牛膝属Achyranthes L.植物牛膝A.bidentata Blume的干燥根, 具有补肝肾、强筋骨、引血下行及逐瘀通经等作用[3]。研究表明牛膝可以减少晚期糖基化终产物的积累, 预防神经元变性, 改善卵巢切除大鼠的认知功能[4], 并且常与其他中药配伍共同治疗AD。可见其在治疗AD方面具有广阔的应用前景, 但其物质基础与作用机制尚不清楚, 需进一步研究。
 
 
网络药理学具有整体性、系统性的特点, 与中医药辨证论治的整体思想不谋而合, 能够在诠释中药活性成分和作用靶点、阐明作用机制、预测新的并发症、发现中药的组效关系、优化复方和寻找新药等方面发挥重大作用。本研究以牛膝为对象, 利用网络药理学工具, 构建牛膝“成分-靶点-通路-机制-AD”复杂网络, 进一步阐明牛膝防治AD多成分、多靶点和多通路的特点, 为拓宽中药牛膝临床应用提供实验依据。
 
1 材料与方法
 
1.1 材料
 
 
Uniprot数据库 (http://www.uniprot.org) ;Pubmed数据库 (http://pubmed.cn) ;中药系统药理学技术平台 (TCMSP) 数据库 (http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php) ;KEGG数据库 (http://www.kegg.jp) ;PDB数据库 (http://www.rcsb.org) ;Drug Bank数据库 (https://www.drugbank.ca) ;Discovery Studio 3.5;Cytoscape3.2.1。Discovery Studio 3.5软件运行环境:Microsoft Windows 7 Home Basic操作系统。其余软件运行环境:Microsoft Windows 8 Home Basic操作系统。
 
1.2 方法
 
1.2.1 牛膝化学成分的收集及前处理
 
 
TCMSP数据库可以用于有效成分鉴定、药物靶点筛选和化合物靶标-疾病网络构建[5,6]。通过文献调研与查阅TCMSP共获得了牛膝的176个化学成分, 下载并将其保存为mol2文件格式, 导入软件Discovery Studio3.5中, 利用里宾斯基 (Lipinski) 类药性五原则筛选符合临床给药的化学成分集, 后经赋CHARMm力场、能量最小化处理, 即可用于分子对接。
 
1.2.2 靶蛋白的收集及前处理
 
 
查阅有关AD发病机制的中外文献, 并收集DrugBank数据库[7]中与AD发病密切相关的靶蛋白。在PDB数据库[8]下载所选靶蛋白, 将靶蛋白导入Discovery Studio 3.5软件, 进行可靠性验证, 将验证通过的靶蛋白分子的二级结构显示方式取消, 以线状方式显示, 并删除靶蛋白水分子, 给蛋白分子加氢, 对非标准名称、非完整的氨基酸及某一残基同时存在多个构象等一系列问题进行校正, 将靶蛋白定义为对接体系中受体分子。通过PDB数据库对该靶蛋白小分子配体的文献说明并通过Pubmed靶蛋白中配体对AD的影响, 选择与AD相关或该靶蛋白特有的小分子配体作为活性中心, 删除位于活性口袋位置的配体小分子, 暴露靶蛋白的活性口袋, 为牛膝化学成分对接靶蛋白做准备。
 
1.2.3 牛膝化学成分与关键蛋白对接
 
 
利用Discovery Studio 3.5的cdocker模块, 将牛膝176个化学成分与靶蛋白进行半柔性对接, 将SDS Site Sphere半径设为9, Top Hit设为3, Pose Cluster Radius设为0.5, 其他参数设置为默认值, 打分函数选取-cdocker energy。
 
1.2.4 分子对接评价标准
 
 
通过查阅相关文献, 在Discovery Studio 3.5的cdocker模块中, cdocker energy的值越低 (即-cdocker energy越高) , 说明化学分子与蛋白受体对接体系越稳定, 对接结果越可靠[9]。对接靶蛋白的数目越多, 与靶蛋白相对应疾病的关系越密切。故选定-cdocker energy≥0且作用靶蛋白数目≥5作为活性分子与AD关键蛋白靶点是否存在较强结合活性的评价标准。
 
1.2.5 网络构建
 
 
根据分子对接评价标准, 得出牛膝治疗AD的有效成分。通过查阅Uniprot数据库, 得到36个靶蛋白的基因名, 并依据KEGG数据库Mapper中的Search Pathway模块, 将筛选的靶蛋白进行通路富集, 设置参与信号通路的靶蛋白数≥3且与AD发病机制相关[10], 得到与AD相关的信号通路集。将牛膝有效成分、筛选的靶蛋白和通路信息导入Cytoscape 3.2.1软件中, 网络中节点 (node) 表示化合物、靶点以及作用通路, 分子与靶蛋白、靶蛋白与信号通路之间的联系则以边 (edge) 相连。经处理后, 得到相关的分子-靶标-通路富集图, 表示牛膝“成分-靶点-通路-AD”间的相互关系。
 
2 结果
 
2.1 对接可靠性验证
 
 
将蛋白晶体结构中的原配体位置作为参考, 将原配体抽离出来, 再重新对接回靶蛋白的活性口袋, 将晶体结构中的配体位置作为参考来计算对接得到的10个配体与其的RMSD值。若得到的RMSD值小于0.2 nm, 说明此对接方法可靠。结果 (表1) 表明所选用的靶蛋白都较可靠, 可用于虚拟筛选。
 
 
表1 与AD发病机制相关靶蛋白及其RMSD值和基因名称Table 1 Target proteins associated with AD pathogenesis and their RMSD values and gene name     下载原表 
表1 与AD发病机制相关靶蛋白及其RMSD值和基因名称Table 1 Target proteins associated with AD pathogenesis and their RMSD values and gene name  
2.2 分子对接结果
 
 
通过Lipinski类药性五原则和分子对接评价后, 依据对接成功靶点数≥5且-cdocker energy≥0共筛选出58个分子 (表2) , 其中有57个分子与20个以上靶蛋白有强烈的相互作用, 30个分子与30个以上靶蛋白有强烈的相互作用。
 
2.3 牛膝“成分-靶蛋白-通路”网络
 
2.3.1 网络特征分析
 
 
通过分子-靶蛋白网络与靶蛋白-信号通路网络基本属性 (表3) 总体分析可得, 牛膝中不仅有多个化合物作用于同一个靶蛋白, 还有单个化合物作用于多个靶蛋白、多个通路, 这正体现了牛膝中药“多成分、多靶点、多通路”协同作用的特点。
 
2.3.2 化学成分分析
 
 
根据Lipinski类药性五原则及与靶蛋白分子对接后结果分析, 可以确定牛膝靶标成分有58个。其中多为小分子烷烃 (庚烷、葵烷、十四烷、十六烷、二十三烷等) 、酯类化合物 (邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸二丁酯、醋酸乙酯、棕榈酸甲酯等) 、羧酸类化合物 (棕榈酸、辛酸、琥珀酸、硬脂酸等) ;其次为黄酮类 (槲皮素、汉黄芩素、山柰酚、黄芩素) 、蒽醌类 (大黄酚) 、香豆素类 (海棠果素E) 等化合物。基于样本数据复杂性与TCMSP数据库用户指南考虑, 按照口服生物利用度 (oral bioavailability, OB) ≥30%, 药物相似性 (drug-likeness, DL) ≥0.18筛选条件对对接后活性成分进一步验证分析, 结果表明有6个化合物有较好的OB与类药性, 其中黄酮类化合物 (槲皮素、汉黄芩素、山柰酚、黄芩素) 具有较高的OB和DL值, 且文献报道这些化合物均具有治疗AD的活性[11,12,13,14]。在数据处理过程中发现蒽醌类化合物大黄酚[15]虽然OB≤30%, 但根据文献调研, 其对防治AD有药理活性。此6个活性成分基本信息见表4。
 
 
表2 依据对接成功靶点数≥5且-cdocker energy≥0筛选出牛膝58个化合物及其TCMSP编号Table 2 Fifty-eight compounds with their TCMSP number successfully docked with five or more targets and-cdocker energy≥0in Achyranthes Bidentata Radix     下载原表 
表2 依据对接成功靶点数≥5且-cdocker energy≥0筛选出牛膝58个化合物及其TCMSP编号Table 2 Fifty-eight compounds with their TCMSP number successfully docked with five or more targets and-cdocker energy≥0in Achyranthes Bidentata Radix  
 
表3 分子-靶蛋白网络与靶蛋白-信号通路网络基本属性Table 3 Basic properties of molecular-target protein network and target protein-signal pathway network     下载原表 
表3 分子-靶蛋白网络与靶蛋白-信号通路网络基本属性Table 3 Basic properties of molecular-target protein network and target protein-signal pathway network  
 
表4 牛膝对接后活性化合物根据OB和DL验证的6个化合物Table 4 Six compounds validated in Achyranthes Bidentata Radix through OB and DL     下载原表 
表4 牛膝对接后活性化合物根据OB和DL验证的6个化合物Table 4 Six compounds validated in Achyranthes Bidentata Radix through OB and DL  
2.3.3 化合物-靶蛋白网络分析
 
 
如图1所示, 矩形代表牛膝活性成分, 菱形代表活性化合物潜在靶点, 如果多个活性成分都落在这个点上, 则菱形就较大, 圆形代表通路, 每条边则代表之间的相互作用关系。本研究建立的牛膝化合物-靶蛋白网络是由58个活性分子及与之相连的36个靶蛋白构成。在筛选后6个化合物中, 具有文献支持治疗AD的5个黄酮和蒽醌类化合物约占总活性成分的8.6%, 与潜在AD靶点的相互作用数大于20。此5个核心活性成分除了作用于Ca2+/钙调蛋白依赖的蛋白激酶IIα (Ca MK-IIα) 、Ca MK-IIβ、Ca MK-IIγ, 凋亡类靶蛋白糖原合成酶激酶-3β (GSK-3β) 、Caspase-3、Caspase-7、B淋巴细胞瘤-2 (Bcl-2) 、蛋白激酶B1 (Akt1) 外, 也都作用于热休克蛋白70 (HSP70) , 胆碱能系统功能蛋白乙酰胆碱酯酶 (AChE) 、丁酰胆碱酯酶 (BChE) , 炎症类靶蛋白肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 、磷酸二酯酶4B (PDE4B) , 氧化应激类靶蛋白血红素氧合酶1 (HO-1) 、单胺氧化酶B (MAO B) 、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ (PPARγ) , γ-氨基丁酸 (GABA) 系统功能类蛋白γ-氨基丁酸A型受体 (GABAA) 等。
 
2.3.4 靶蛋白-信号通路网络分析
 
 
治疗AD的36个靶蛋白在KEGG通路富集中, 有23个靶蛋白 (Ca MK-IIα、Ca MK-IIβ、Ca MK-IIγ、Caspase-3、Caspase-7、Bcl-2、Akt1、GSK-3β等) 能够映射到治疗AD相关的12条通路中, 其中信号通路相对接蛋白约占总靶蛋白的64%。这12条通路包括胰岛素信号通路 (insulin signaling pathway) 、Wnt信号通路 (Wnt signaling pathway) 、有丝分裂原激活的蛋白激酶通路 (MAPK signaling pathway) 、PI3K-Akt信号通路 (PI3K-Akt signaling pathway) 等, 说明靶点蛋白在不同通路间互相调节并进行信号传递。
 
3 讨论
 
 
结合分子对接结果本实验共筛选出58个牛膝化学成分, 进一步根据OB和OL进行筛选, 预测出牛膝中6个治疗AD的活性成分, 其中黄酮类 (槲皮素、汉黄芩素、山柰酚、黄芩素) 、蒽醌类 (大黄酚) 化合物有相关文献报道, 说明该研究方法的合理性。而海棠果素E缺乏文献支持, 故药效学与作用机制需进一步验证。
 
 
根据“化合物-靶蛋白”分子对接结果显示, 5个黄酮类和蒽醌类化合物都对接AD相关的靶蛋白共24个, 其中Ca MK-IIα、Ca MK-IIβ、Ca MK-IIγ, 是脑组织中极其丰富的一种蛋白激酶, 在学习、记忆中发挥着至关重要的作用, 可通过影响tau蛋白过度磷酸化和淀粉样蛋白前体蛋白 (APP) 的磷酸化, 进一步影响细胞内的钙离子浓度, 激活蛋白激酶C和其他钙离子依赖性蛋白激酶以发挥抗AD作用[16]。凋亡类靶蛋白GSK-3β在AD病理发展中 (如记忆障碍、tau蛋白磷酸化、小胶质细胞介导的炎症、炎性因子的释放等) 发挥着关键作用, 而Caspase-7、Caspase-3、Bcl-2可以激活由Aβ蛋白毒性导致的AD[17]。另外, 这些成分均相对接于HSP70蛋白, 胆碱能系统功能蛋白AchE、BchE, 炎症类靶蛋白TNF-α、PDE4B, 氧化应激类靶蛋白HO-1、MAO B、PPARγ, GABA系统功能类蛋白GABA A等, 预测牛膝活性成分可通过TNF-α、HSP70、Caspase-3激活MAPK激酶调节神经元细胞的凋亡, 减少氧化自由基的生成和增强抗氧化酶的活性, 拮抗由兴奋性氨基酸介导的神经毒性, 抑制乙酰胆碱酯酶活性等, 进而有效的治疗AD。
 
图1 牛膝“成分-靶蛋白-通路”网络图Fig.1 Network diagram of“component-target protein-pathway”in Achyranthes Bidentata Radix  
图1 牛膝“成分-靶蛋白-通路”网络图Fig.1 Network diagram of“component-target protein-pathway”in Achyranthes Bidentata Radix   下载原图
 
 
 
MAPK是一组脯氨酸依赖的蛋白激酶, 参与了细胞增殖、氧化和凋亡等多种生理功能[18]。MAPK signaling pathway在哺乳动物类细胞主要由p38signaling pathway、ERK signaling pathway和JNK signaling pathway组成。由靶点-信号通路网络图可知, 与MAPK signaling pathway相接的靶蛋白有Akt1、Caspase-3、HSP70和TNF-α, 主要与p38与JNK通路相关。p38与JNK都是应激激活蛋白激酶, TNF-α会激活p38。p38是神经炎症机制的重要调控蛋白, 在Aβ介导的氧化应激时可促进炎症因子的生成, 加速诱导tau蛋白磷酸化, 进而引起细胞的凋亡[18]。研究表明, 槲皮素[19]、汉黄芩素[20]、黄芩素[21]和山柰酚[22]可通过下调p38MAPK磷酸化, 减少炎性反应, 抑制细胞凋亡。
 
 
Wnt signaling pathway在中枢神经系统中对细胞间黏附和细胞分化方面发挥着十分重要的作用[23]。靶蛋白Ca MK-IIα、Ca MK-IIβ、Ca MK-IIγ、γsecretase和GSK-3β富集于Wnt signaling pathway中。β-catenin为Wnt下游的调控因子, 研究表明Wnt/β-catenin signaling pathway可保护神经元细胞, 并调节细胞内钙离子的浓度, 防止钙离子浓度增加进一步激活Ca MK导致Tau蛋白过度磷酸化, 抑制神经元细胞的凋亡[24]。据报道, 黄芩素[25]、汉黄芩素[26]、槲皮素[27]和山柰酚[28]可通过激活Wnt/β-catenin signaling pathway使细胞再生。
 
 
PI3K-Akt signaling pathway与m TOR signaling pathway相互交叉, 经典m TOR signaling pathway由PI3K-Akt-mTOR signaling pathway多层次调节神经元细胞发育、学习与记忆。在此通路中, Akt发挥着关键的作用, Akt磷酸化可以正反馈地刺激m TOR signaling pathway活化, m TOR signaling pathway的活化对Akt有负反馈抑制作用[29]。各种细胞因子可以使PI3K磷酸化, 进而将2个Akt激酶磷酸化, 引起Akt活化与细胞膜结合。m TOR是非经典苏氨酸/丝氨酸的蛋白激酶, 也是Akt下游的靶点之一, 不仅可以促进Aβ的形成, 还通过调节Tau蛋白的3个磷酸化位点控制Tau蛋白的合成和聚集[30]。据文献报道, 槲皮素[31]、汉黄芩素[32]诱导PI3K-Akt-mTOR signaling pathway蛋白的表达, 促进细胞增殖。
 
 
Insulin signaling pathway受损也是AD发病机制之一, 研究显示[33]AD患者患病早期会出现葡萄糖利用率降低, 由于胰岛素抵抗导致神经元缺少糖分而能量不足。脑内insulin signaling pathway减弱, 不仅使脑内p-Akt水平和PI3K/Akt信号转导下调, 导致GSK-3β活性增强, tau蛋白过度磷酸化, 还进一步导致神经原纤维缠结 (NFT) 形成和神经元细胞凋亡。KEGG“成分-靶蛋白-通路”富集网络图中, 虽然出现insulin signaling pathway, 但经文献检索, 暂未发现牛膝活性成分通过抑制胰岛素代谢障碍来防治AD, 说明其活性成分需要进一步实验支撑。
 
 
本研究基于网络药理学方法对牛膝药效成分进行靶标预测和通路分析, 通过建立药效成分-靶点-通路网络图, 多角度探索牛膝治疗AD潜在的作用机制, 发现牛膝中黄酮类和蒽醌类药效成分可能通过抗细胞凋亡、抗氧化应激、减少炎症反应等机制发挥抗AD作用, 为其后续临床试验疗效评价指标的筛选提供依据和方向。同时, 对于文献中证明有治疗AD作用的生物碱类、甾醇类化合物, 本研究并未筛选得到, 说明实验方法还存在一些局限性, 网络药理学研究结果仍需要后续实验的验证与支持, 并使其相关数据库建设、算法创建、分子筛选依据等不断完善。
 

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文章名称:基于网络药理学的牛膝防治阿尔茨海默病的物质基础与作用机制研究

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