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基于灰色关联度与正交偏最小二乘法分析的苍术挥发油燥性谱效关系研

分类:(二) 发表时间:2019-08-18

苍术Atractylodis Rhizoma为菊科植物茅苍术Atractylodes lancea (Thumb.) DC.或北苍术A.chinensis (DC.) Koidz.的干燥根茎, 具有燥湿健脾、祛风散寒、明目的功效, 用于湿阻中焦、脘腹胀满、泄泻、水肿、
 
苍术Atractylodis Rhizoma为菊科植物茅苍术Atractylodes lancea (Thumb.) DC.或北苍术A.chinensis (DC.) Koidz.的干燥根茎, 具有燥湿健脾、祛风散寒、明目的功效, 用于湿阻中焦、脘腹胀满、泄泻、水肿、脚气痿蹵、风湿痹痛、风寒感冒、夜盲、眼目昏涩[1]。生苍术燥性强烈, 麸炒燥性缓和, 古人对此早有认识。《本草纲目》中记载:“苍术性燥, 故以糯米泔浸去其油切片焙干用, 以制其燥者”。然而, 燥性也是中药的重要性能之一, 对不同病症患者, 其或表现为副作用, 或表现为治疗作用[2]。苍术具有燥脾湿之功效, 但历版《中国药典》均亦记载其能治疗水肿、风湿等湿症。为充分利用苍术的燥性, 使其更好应用于临床, 有必要进一步明确其燥性的主要物质基础。目前, 对于苍术的燥性研究甚少, 课题组前期对苍术的燥性部位进行了初步探索, 确定了苍术的主要燥性部位是挥发油部位, 也初步确立了苍术燥性评价指标[3]。基于前期研究基础, 本研究通过收集多批次的苍术, 建立苍术挥发油气相色谱-质谱 (GC-MS) 指纹图谱, 通过灰色关联度及正交偏最小二乘法分析, 初步确定苍术的主要燥性成分, 为苍术燥性的临床应用提供参考。
 
1 材料
 
1.1 仪器
 
 
Trace1300气相色谱仪和ISQ型质谱联用仪、Xcalibur数据处理系统NIST标准质谱图库 (Thermo Fisher公司) ;MEN-C100A全自动血液流变仪 (上海泰益医疗仪器设备有限公司) ;352型酶标仪 (芬兰Labsystems Multiskan MS公司) 。
 
1.2 试剂
 
 
大豆油[湖北省粮油 (集团) 有限公司];无水硫酸钠 (国药集团化学试剂有限公司) ;乙醚 (上海马陆制药厂) ;牛血清白蛋白 (BSA, 北京索莱宝科技有限公司) ;大鼠水通道蛋白 (AQP2) 酶联试剂盒 (武汉基因美生物科技有限公司) 。
 
1.3 试药
 
 
苍术药材样品来源见表1, 经湖北中医药大学药学院张秀桥教授鉴定为菊科苍术属植物茅苍术Atractylodes lancea (Thunb.) DC.的干燥根茎。
 
1.4 实验动物
 
 
SPF级SD大鼠, 雄性, 体质量180~220 g, 由湖北省实验动物研究中心提供, 许可证号SCXK (鄂) 2015-0018。
 
 
表1 苍术药材样品来源Table 1 Source of Atractylodis Rhizoma     下载原表 
表1 苍术药材样品来源Table 1 Source of Atractylodis Rhizoma  
2 方法与结果
 
2.1 苍术挥发油GC-MS指纹图谱的建立
 
2.1.1 供试品溶液的制备
 
 
称取500 g生苍术饮片, 装入5 L圆底烧瓶中, 加入3 000 mL蒸馏水, 加热提取挥发油, 温度控制在100℃左右, 至挥发油的量不再增加。蒸馏液用乙醚萃取, 萃取后用无水硫酸钠干燥, 滤过, 自然挥干, 得挥发油, 挥发油为淡黄色透明油状物, 得率为5%。精密称定0.1 g挥发油置于10 mL量瓶中, 加甲醇, 定容, 过0.45μm微孔滤膜, 得供试品溶液。
 
2.1.2 GC-MS条件
 
 
TG-1701毛细管柱 (60 mm×0.25 mm, 0.25μm) ;程序升温:起始柱温100℃, 维持2 min, 以2℃/min升至180℃, 维持6 min, 以30℃/min升至270℃, 维持5 min。进样口温度300℃;体积流量0.8 mL/min;分流比30∶1;进样量1μL;载气为高纯氮气 (99.99%) ;接口温度280℃;EI电离:离子源温度300℃;电子轰击能量70 e V;采集方式为全扫描模式, 扫描范围m/z 35~500;溶剂延迟时间为4 min。
 
2.1.3 精密度试验
 
 
取适量苍术饮片 (S1) , 按照“2.1.1”项制得供试品溶液, 按“2.1.2”项下色谱条件, 连续进样6次, 将图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统 (2004A版) ”, 得到各图谱的相似度均大于0.96, 计算35个主要共有峰相对保留时间RSD<2%, 峰面积RSD<2%, 表明此方法精密度较好。
 
2.1.4 稳定性试验
 
 
取适量苍术饮片 (S1) , 按照“2.1.1”项制得供试品溶液, 分别在0、2、4、6、8、12 h, 按“2.1.2”项色谱条件进行测定, 将所得数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统 (2004A版) ”, 得到各图谱的相似度均大于0.96, 计算35个主要共有峰相对保留时间RSD<2%, 峰面积RSD<2%, 表明供试品溶液在12 h内稳定。
 
2.1.5 重复性试验
 
 
取适量苍术饮片 (S1) , 按照“2.1.1”项下方法平行制得6份供试品溶液, 按“2.1.2”项色谱条件进行测定, 将数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统 (2004A版) ”, 得到各图谱的相似度均大于0.96, 计算35个主要共有峰相对保留时间RSD<2%, 峰面积RSD<2%, 表明该方法重复性较好。
 
2.1.6 苍术挥发油GC-MS指纹图谱建立
 
 
将9批苍术饮片按“2.1.1”项制得挥发油供试品溶液, 按照“2.1.2”项下的测定条件进样测定, 并记录各批次样品色谱数据。将9批苍术挥发油GC-MS图谱数据导入到“中药色谱指纹图谱相似度评价系统 (2004A版) ”, 设定参照图谱, 将谱峰自动匹配, 生成叠加图谱见图1, 得到的35个共有峰见图2, 生成的共有峰匹配数据见表2。
 
图1 9批苍术挥发油 (S1~S9) GC-MS指纹图谱叠加图和对照图谱 (R) Fig.1 GC-MS fingerprints of volatile oil from nine batches of Atractylodis Rhizoma (S1—S9) and control fingerprint (R)  
图1 9批苍术挥发油 (S1~S9) GC-MS指纹图谱叠加图和对照图谱 (R) Fig.1 GC-MS fingerprints of volatile oil from nine batches of Atractylodis Rhizoma (S1—S9) and control fingerprint (R)   下载原图
 
 
2.2 苍术燥性药效学实验
 
2.2.1 试药的制备
 
 
参照课题组前期研究给药剂量制备试药[3]。分别取9批适量生苍术挥发油于量瓶中, 加入大豆油, 定容, 混匀, 配成0.05 g/mL的生苍术挥发油高剂量试药 (相当于生药量1 g/mL) , 并标号S1~S9。
 
2.2.2 动物分组与给药
 
 
采用随机数字表法将100只SD大鼠分为10组 (每组10只) 。适应性饲养1周后开始ig给药, S1~S9组分别给予S1~S9号挥发油试药, 第10组作为对照组给予等体积生理盐水, 连续给药21 d。
 
2.2.3 饮水量的测定
 
 
按照每只大鼠每日饮水量 (即体质量150 g的大鼠每24 h的饮水量) 计算, 每日定时添加饮用水并测量, 各组所剩水质量 (M1) 与前1 d所给水质量 (M0) 之间的差值即为该组大鼠当日总饮水量。所得总饮水量除以该组大鼠个数, 即为该组大鼠日平均饮水量。测定结果见图3。
 
2.2.4 血液流变学指标测定
 
 
大鼠ip 20%乌拉坦溶液麻醉后, 腹主动脉取血约2 mL, 置于含有肝素抗凝的采血管中。吸取大鼠抗凝血2 m L缓慢加入血液流变仪的样品槽中, 在37℃恒温下测量切变率为1/s的全血黏度, 测定结果见图4。
 
图2 9批苍术挥发油GC-MS指纹图谱共有峰Fig.2 Common peak map of GC-MS fingerprints of volatile oil from nine batches of Atractylodis Rhizoma  
图2 9批苍术挥发油GC-MS指纹图谱共有峰Fig.2 Common peak map of GC-MS fingerprints of volatile oil from nine batches of Atractylodis Rhizoma   下载原图
 
 
2.2.5 肾脏中AQP2量的测定
 
 
处死大鼠, 迅速取出肾脏, 匀浆, 参照AQP2试剂盒测定方法测定肾脏中AQP2的量, 测定结果见图5。
 
2.3 灰色关联度分析
 
2.3.1 原始数据的无量纲化处理[4,5]
 
 
原始数据的变换采用初值化变换法。变换的母序列记为{X0 (t) }, 子序列记为{Xi (t) }。将苍术燥性效应不同的药效指标作为母序列, 苍术各批次的特征峰峰面积作为子序列。
 
2.3.2 绝对差序列及关联系数的计算
 
 
在t=k时 (k为峰号) , 母序列记为{X0 (k) }, 子序列记为{Xi (k) }, 母序列与子序列的绝对差序列Δ0i (k) =|X0 (k) -Xi (k) | (1≤i≤m) 。计算在t=k时母序列与子序列的关联系数η (k) 。
 
 
 
 
 
Y0 (k) 为苍术燥性效应不同的药效指标;Yi (k) 为苍术各批次的特征峰峰面积归一化数值;k为峰号;ρ为分辨系数, 作用是削弱最大绝对差数值的失真, 提高关联系数之间的显著性差异, ρ∈ (0, 1) , 本实验中ρ取0.5;∣Y0 (k) -Yi (k) ∣为母序列与子序列的绝对差值;minimin∣Y0 (k) -Yi (k) ∣为绝对差值的最小值, 又记为Δmin;maximax∣Y0 (k) -Yi (k) ∣为绝对差值的最大值, 又记为Δmax
 
 
表2 9批苍术挥发油GC-MS指纹图谱共有峰峰面积数据Table 2 Common peak area matching data of GC-MS fingerprints of volatile oil from nine batches of Atractylodis Rhizoma     下载原表 
表2 9批苍术挥发油GC-MS指纹图谱共有峰峰面积数据Table 2 Common peak area matching data of GC-MS fingerprints of volatile oil from nine batches of Atractylodis Rhizoma  
2.3.3 关联度 (r) 的计算
 
 
r实质上是对时间序列几何关系的比较, 是母序列与子序列各个时刻的关联系数的平均值。
 
 
 
 
 
n为子序列的数据个数
 
 
计算得到的各组结果见表3~5。
 
图3 各组大鼠日平均饮水量 (, n=10) Fig.3 Average daily drinking water per rat in each group (, n=10)  
图3 各组大鼠日平均饮水量 (, n=10) Fig.3 Average daily drinking water per rat in each group (, n=10)   下载原图
 
 
与对照组比较:*P<0.05, 下同*P<0.05 vs control group, same as below
 
图4 各组大鼠在切变率为1 s-1时的全血黏度 (, n=10) Fig.4 Blood viscosity of rats in each group at shear rate of1 s-1 (, n=10)  
图4 各组大鼠在切变率为1 s-1时的全血黏度 (, n=10) Fig.4 Blood viscosity of rats in each group at shear rate of1 s-1 (, n=10)   下载原图
 
 
图5 各组大鼠肾脏中AQP2表达量 (, n=10) Fig.5 Content of aquaporin AQP2 in kidney of rats in each group (, n=10)  
图5 各组大鼠肾脏中AQP2表达量 (, n=10) Fig.5 Content of aquaporin AQP2 in kidney of rats in each group (, n=10)   下载原图
 
 
 
由表3可知, 与饮水量关联度大于0.5的峰共有9个, 分别是峰31、28、29、33、23、27、25、24、16, 其关联度大小依次为峰31>28>29>33>23>27>25>24>16。
 
 
表3 日平均饮水量与各特征峰峰面积的关联度Table 3 Correlation between daily average drinking water volume and each characteristic peak area     下载原表 
表3 日平均饮水量与各特征峰峰面积的关联度Table 3 Correlation between daily average drinking water volume and each characteristic peak area  
 
由表4可知, 与全血黏度关联度大于0.5的峰共有8个, 分别是峰32、28、29、33、31、16、27、25, 其关联度大小依次为峰32>28>29>33>31>16>27>25。
 
 
由表5可知, 与AQP2含量关联度大于0.5的峰共有7个, 分别是峰27、25、31、29、28、33、30, 其关联度大小依次为峰27>25>31>29>28>33>30。
 
 
综合以上3个燥性药效指标求得的关联峰, 其共有的关联峰共有6个, 分别为峰25、27、28、29、31、33, 初步确定燥性相关成分有6个。
 
2.4 正交偏最小二乘法验证
 
 
灰色关联度分析方法虽然能够很好地识别出与燥性药效具有较高相关性的峰, 但其不足之处是不能识别出哪些是与燥性呈正相关的峰, 哪些是与燥性呈负相关的峰。本研究选择的3个药效指标中, 饮水量、全血黏度与苍术燥性呈正相关, 而AQP2量与苍术燥性呈负相关, 故选择AQP2含量数据, 将其同6个共有峰峰面积数据一同导入到SIMCA-P14.1软件中, 通过正交偏最小二乘法进一步验证6个峰与燥性的相关性, 得到其标准化回归系数图, 见图6。由图6可以看出, 峰28、31、33与AQP2含量呈负相关, 峰25、27、29与AQP2含量呈正相关。故可以初步确定出苍术燥性成分为峰28、31、33。
 
 
表4 切变率为1 s-1时全血黏度与各特征峰峰面积的关联度Table 4 Correlation between blood viscosity and peak area of each characteristic peak at shear rate of 1 s-1     下载原表 
表4 切变率为1 s-1时全血黏度与各特征峰峰面积的关联度Table 4 Correlation between blood viscosity and peak area of each characteristic peak at shear rate of 1 s-1  
 
表5 肾脏中AQP2含量与各特征峰峰面积的关联度Table 5 Correlation between AQP2 content in kidney and peak area of each characteristic peak     下载原表 
表5 肾脏中AQP2含量与各特征峰峰面积的关联度Table 5 Correlation between AQP2 content in kidney and peak area of each characteristic peak  
图6 标准化回归系数图Fig.6 Normalized regression coefficient diagram  
图6 标准化回归系数图Fig.6 Normalized regression coefficient diagram   下载原图
 
 
2.5 燥性成分的谱库检索
 
 
经过检索ThermoFisher公司Xcalibur数据处理系统NIST标准质谱图库的谱库, 初步确定峰31、33、28对应的3种燥性成分为β-桉叶醇、异愈创木醇、马兜铃烯, 见表6。
 
 
表6 3种燥性成分信息Table 6 Three kinds of dryness components information     下载原表 
表6 3种燥性成分信息Table 6 Three kinds of dryness components information  
3 讨论
 
 
中药成分复杂多样, 药理作用众多, 不同的成分发挥着不同的药效。仅凭简单的含量测定, 将含量高的成分认定为药效成分不够科学。同时, 将炮制前后量变最大的成分作为药效成分也不够全面。因此通过数学建模与计算机软件建模, 分析中药指纹图谱与药效学指标之间的内在相关性, 从而筛选出中药药效主要成分, 较为科学和合理。目前谱效关系研究的建模方法众多, 且各有优势与不足。近年来, 灰色关联度分析法被广泛应用于中药谱效研究[5,6,7]。通过分析不同批次色谱峰数值的变化与药效数值的变化, 变化趋势一致则关联度高, 变化趋势不一致则关联度低。灰色关联度分析对样本数据要求低, 但也存在缺点, 如易受分辨系数等的影响。关联度值均为正值, 只能反映成分与药效相关性的大小, 并不能反映与药效呈负相关的化学成分, 即不能正确地分析化学成分对药效的综合贡献[8]。故而在实际分析时, 很多学者在谱效学的研究中更趋向于采用2种及以上的分析方法联合应用[9]。正交偏最小二乘回归分析是以主成分分析、典型相关分析和多元线性回归分析方法为基础的新型多元统计分析方法, 在分析多因素模型时, 可直观地分析图谱中各特征峰对药效的综合贡献, 更易于辨识系统信息与噪声, 回归系数更容易解释和分析, 可以很好地弥补灰色关联度分析的不足。
 
 
传统中医理论认为燥性干涩, 最易伤及人体津液, 从而导致一系列干燥失润的病理现象, 表现有口渴多饮等。故在研究苍术燥性时, 饮水量是苍术燥性的重要指标[10]。燥伤津液, 而中医理论认为津血同源, 津液耗损势必会影响到血液的流变学, 故在研究苍术燥性时, 全血黏度也是苍术燥性的重要指标[11]。全血黏度一般会有几个不同切变率下的全血黏度数值, 为了简化计算, 方便分析, 本研究统一选择第1个切变率下的全血黏度数值作为代表进行分析。AQP是一类具有高度选择性运输水的膜通道蛋白家族。AQP2是AQP家族中的一员, 存在于肾脏集合管的主细胞中, 是抗利尿激素 (ADH) 敏感性蛋白, ADH经过一系列机制激发, 促进含AQP小泡向腔膜上镶嵌, 并使AQP开放从而提高腔膜对水的通透性, 促进尿液重吸收, 大量研究表明尿量的增加可能与AQP2的降低有关[12,13,14], 检测AQP2的含量可以客观地反映水液代谢状况。故AQP2的含量可以作为衡量苍术燥性指标之一。课题组前期研究表明长期给予高剂量的苍术挥发油, 会使正常健康大鼠的饮水量显著增加, 血液黏度也会显著增加, 同时AQP2的量显著降低。故本研究选择饮水量、全血黏度、AQP2含量作为苍术燥性的代表性药效指标。
 
 
本研究基于苍术挥发油的GC-MS指纹图谱, 通过灰色关联度分析和正交偏最小二乘分析的联合运用, 初步确定出苍术的燥性成分有β-桉叶醇、马兜铃烯、异愈创木醇。有研究表明β桉叶醇可能是苍术燥性成分[13,15,16], 但未见马兜铃烯、异愈创木醇是燥性成分的相关报道, 可能是由于苍术中β-桉叶醇的含量高而马兜铃烯、异愈创木醇含量较低。相关研究表明, 几种含马兜铃烯的中药均有不同的除湿、利水的功效, 如水菖蒲根的挥发油中含15.71%的马兜铃烯, 有除湿的功效[17];广防己挥发油中含3.68%的马兜铃烯, 有利水消肿的功效[18];缬草根的化学成分中含0.23%的马兜铃烯, 能治疗风湿痹痛[19];吴茱萸中含有一定的马兜铃烯, 也有燥湿的功效[20];甘松中也含有马兜铃烯, 外用可以祛湿消肿[21]。综上, β-桉叶醇、马兜铃烯均可能是苍术的主要燥性物质, 而异愈创木醇的研究较少, 其是否有燥湿利水的功效有待进一步研究。
 
 
本研究初步明确了苍术主要燥性成分有β-桉叶醇、马兜铃烯、异愈创木醇, 为苍术燥性物质基础研究提供了参考, 进一步完善了苍术燥性理论, 为其临床拓展应用提供了一定的基础。
 

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文章名称:基于灰色关联度与正交偏最小二乘法分析的苍术挥发油燥性谱效关系研

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