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人参皂苷Rg3调节免疫检查点PD-L1抑制肺癌Lewis细胞增殖的作用及机制研究

分类:(二) 发表时间:2019-08-18

非小细胞肺癌 (non-small cell lung cancer, NSCLC) 是致死率极高的一类恶性肿瘤, 居我国恶性肿瘤发病率及致死率之首[1]。近年来, 肿瘤免疫治疗成为研究的热点, 同时给NSCLC药物研究带来新希望
 
非小细胞肺癌 (non-small cell lung cancer, NSCLC) 是致死率极高的一类恶性肿瘤, 居我国恶性肿瘤发病率及致死率之首[1]。近年来, 肿瘤免疫治疗成为研究的热点, 同时给NSCLC药物研究带来新希望。机体免疫系统通过免疫监视清除肿瘤细胞, 然而当程序性死亡分子1配体 (PD-L1) 高表达后, 导致机体免疫功能被抑制, 肿瘤细胞逃避机体免疫监视和T细胞的杀伤作用[2]。研究表明, 在NSCLC实体瘤中常见PD-L1过度表达[3]。因此, 寻找抑制PD-L1的药物将成为治疗NSCLC的新方向。
 
 
人参皂苷Rg3是多种人参皂苷成分中免疫调节作用最显著的小分子物质, 研究表明人参皂苷Rg3可通过多种途径增强机体对肿瘤细胞的免疫能力[4]。然而人参皂苷Rg3与免疫检查点之间的关联研究较少。人参皂苷调节免疫发挥抗肿瘤的作用是否与调控PD-L1表达有关尚不明确。本研究对人参皂苷Rg3影响PD-L1表达的作用进行研究, 并初步探索其作用机制, 为抑制PD-L1的中药新药开发提供参考。
 
1 材料
 
1.1 细胞
 
 
小鼠非小细胞肺癌Lewis细胞 (LLC) 源于ATCC细胞库。
 
1.2 药品与试剂
 
 
人参皂苷Rg3 (成都曼思特生物科技有限公司, 质量分数98.44%, 批号MUST-16030711) ;DMEM基础培养基、胎牛血清 (Gibco公司) ;RIPA裂解液+PMSF (北京鼎国昌盛生物技术有限公司) ;磷酸酶抑制剂 (江苏凯基生物技术有限公司) ;ECL化学发光试剂盒 (Millipore公司) ;MTT (Promega公司) ;γ干扰素 (IFN-γ, Peproted公司) ;IFN-γ稀释液 (杭州联科生物技术有限公司) ;流式细胞术PD-L1抗体 (eBioscience公司) ;免疫荧光PD-L1抗体、GAPDH抗体 (Proteintech公司) ;哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (m TOR) 抗体 (Abclonal公司) ;蛋白激酶B (Akt) 、p-Akt、PI3抗体 (CST公司) ;山羊抗小鼠IgG H&L (Abcam公司) ;二抗 (Bioword公司) ;DAPI染色液 (Beyotime公司) 。
 
1.3 仪器
 
 
CO2细胞培养箱, Thermo公司;酶标仪, 美国BioTek公司;Flow Cytometer C6流式细胞计数仪, BD公司;荧光倒置显微镜, Zeiss公司;凝胶成像系统, 美国Bio-Rad公司。
 
2 方法
 
2.1 MTT法检测人参皂苷Rg3对LLC增殖的影响
 
 
DMEM完全培养基 (DMEM基础培养基+10%胎牛血清+青霉素+链霉素) 培养LLC, PBS清洗2遍, 胰酶消化, 离心后计数, 调整细胞数为8×103个/mL, 接种于96孔细胞培养板, 每孔加入200μL细胞悬液, 培养12~24 h细胞待贴壁并显示形态。实验分为对照组及人参皂苷Rg3 1、2、4、8、16、32、64、128μmol/L组。每组设置6个平行孔。5%CO2、37℃的饱和湿度培养箱孵育24、48 h后, 弃去上清, 各孔加入100μL基础培养基DMEM和MTT 10μL, 孵育4 h, 移除上清, 各孔加入DMSO100μL溶解, 震荡5 min混匀后, 在490 nm处读取其吸光度 (A) 值。
 
2.2 长时程细胞动态监测人参皂苷Rg3对LLC增殖的影响
 
 
DMEM完全培养基培养LLC, PBS清洗2遍, 胰酶消化, 离心后计数, 调整细胞数为8×103个/mL, 接种于96孔细胞培养板, 每孔加入200μL细胞悬液, 培养12~24 h待细胞贴壁并显示形态。实验分组同“2.1”项。给药后置于CO2细胞培养箱中, 培养24、48 h, 每小时拍照记录进行细胞长时程动态监测。
 
2.3 流式细胞术筛选IFN-γ诱导PD-L1表达的有效浓度
 
 
取对数生长期的LLC, PBS清洗2遍, 胰酶消化, 离心后计数, 调整细胞数为1×105/mL, 接种于6孔板上, 每孔加入2 m L细胞悬液。提前用稀释液配制不同质量浓度的IFN-γ。细胞分为IgG阴性对照组及IFN-γ10、20、30 ng/mL组, 每组设置3个平行对照孔。各组分别加入对应药物继续培养24 h, PBS清洗2遍, 不含EDTA的胰酶轻轻吹打消化, 1 000 r/min、5 min离心后计数, 调整细胞数为5×106个/m L。除阴性对照组外各组每200μL体系加入1μL PD-L1抗体, 阴性对照组每200μL体系加入1μL山羊抗小鼠IgG。常温孵育15 min后500×g离心5 min, 弃上清加入100μL PBS重悬, 采用Flow Cytometer C6检测PD-L1表达。
 
2.4 流式细胞术检测人参皂苷Rg3对LLC PD-L1表达的影响
 
 
取对数生长期的LLC, PBS清洗2遍, 胰酶消化, 离心后计数, 调整细胞数为1×105个/mL, 接种于6孔板, 每孔加入2 m L细胞悬液。实验分为对照组、模型组及人参皂苷Rg3 16、32、64、128μmol/L组, 每组设3个平行孔。除对照组外每孔分别加入20 ng/mL的IFN-γ诱导PD-L1表达, 培养24 h后, 各给药组分别给予不同浓度的人参皂苷Rg3, 对照组及模型组加入DMSO。继续培养24 h, 检测各组PD-L1表达, 方法同“2.3”项。
 
2.5 免疫荧光法检测人参皂苷Rg3对LLC PD-L1表达的影响
 
 
取对数生长期的LLC, PBS清洗2遍, 胰酶消化, 调整细胞数为1×105个/mL, 接种于6孔板 (内含细胞爬片) , 每孔加入2 mL细胞悬液。实验分组及处理同“2.4”项。继续培养24 h后, PBS洗涤, 多聚甲醛固定10 min, 0.1%Triton X-100透化10min, 1%BSA室温封闭30 min, 一抗PD-L1 (1∶10) 4℃孵育过夜, 山羊抗小鼠IgG (1∶1 000) 4℃孵育2 h, Hochest33342孵育5 min, 封片, 荧光倒置显微镜下观察, 放大400倍拍摄。
 
2.6 Western blotting法检测PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白表达
 
 
取对数生长期的LLC, 接种于6孔板。实验分为对照组、人参皂苷Rg3 16、32、64μmol/L组。培养24 h后, 对照组给予DMSO, 各给药组给予不同浓度人参皂苷Rg3。继续培养24 h, PBS清洗2遍, 加入细胞裂解液 (RIPA裂解液-蛋白酶抑制剂-磷酸酶抑制剂100∶1∶1) 冰上裂解细胞, 离心取上清, 加入5×loading buffer (1∶4) , 100℃变性10 min, 样品保存于-20℃。蛋白样品上样量25μg, 电泳条件40 A, 100 min, 转膜条件100 V, 90 min。加入一抗 (m TOR、Akt、p-Akt、PI3K) 4℃孵育过夜, 二抗室温孵育2 h, TBST洗涤后ECL发光液显影。使用Gelpro凝胶分析软件进行蛋白条带灰度分析。
 
2.7 统计学分析
 
 
采用SPSS 17.0软件对实验数据进行统计学处理分析, 结果以表示, 各组间采用单因素方差分析比较, 样本均数间比较采用LSD-t检验。
 
3 结果
 
3.1 人参皂苷Rg3对LLC增殖的影响
 
 
不同浓度的人参皂苷Rg3作用于LLC 24、48 h后, MTT结果显示 (图1) , 人参皂苷Rg3在浓度为16、32、64、128μmol/L时能够显著抑制LLC增殖, 其他浓度下人参皂苷Rg3未明显抑制LLC增殖。24、48 h长时程细胞动态监测显示 (图2) , 人参皂苷Rg3呈浓度依赖性地抑制LLC增殖。由此可见, 人参皂苷Rg3能够显著抑制LLC增殖, 其抑制作用呈现出时间和浓度依赖性。
 
3.2 IFN-γ诱导PD-L1表达的浓度筛选
 
 
IFN-γ是协调肿瘤免疫应答的中枢细胞因子之一。肿瘤浸润淋巴细胞产生IFN-γ, 进一步启动细胞周期停滞并诱导相邻肿瘤细胞的细胞凋亡[5]。然而, 研究表明IFN-γ通过调控细胞周期素依赖蛋白激酶5 (CDK5) 上调PD-L1表达, 促进肿瘤细胞免疫逃逸[6]。本实验分别采用10、20、30 ng/mL的IFN-γ诱导PD-L1表达, 结果 (图3) 显示IFN-γ质量浓度高于20 ng/mL时显著增加LLC中PD-L1的表达 (P<0.001) 。因此, 在后续实验中选用20 ng/m L IFN-γ构建PD-L1高表达的LLC体外实验模型。
 
3.3 人参皂苷Rg3对LLC PD-L1表达的影响
 
 
IFN-γ诱导PD-L1表达后, 分别以人参皂苷Rg316、32、64、128μmol/L干预LLC。免疫荧光结果显示 (图4) , 与对照组比较, 模型组PD-L1高表达于LLC细胞膜表面 (红色) , 人参皂苷Rg3干预后, PD-L1表达显著降低 (P<0.01、0.001) 。流式细胞计数结果显示 (图5) , 与对照组比较, 模型组细胞PD-L1表达显著增加 (P<0.001) 。与模型组比较, 人参皂苷Rg3呈浓度依赖性地降低PD-L1的表达 (P<0.05、0.001) 。
 
图1 人参皂苷Rg3对LLC增殖的影响 (, n=6) Fig.1 Inhibitory effects of ginsenoside Rg3 on proliferation of LLC (, n=6)  
图1 人参皂苷Rg3对LLC增殖的影响 (, n=6) Fig.1 Inhibitory effects of ginsenoside Rg3 on proliferation of LLC (, n=6)   下载原图
 
 
与对照组比较:*P<0.05**P<0.01***P<0.001*P<0.05**P<0.01***P<0.001 vs control group
 
图2 长时程细胞动态监测人参皂苷Rg3对LLC增殖的影响 (, n=6) Fig.2 Inhibitory effects of ginsenoside Rg3 on proliferation of LLC by cell long-term dynamic monitoring (, n=6)  
图2 长时程细胞动态监测人参皂苷Rg3对LLC增殖的影响 (, n=6) Fig.2 Inhibitory effects of ginsenoside Rg3 on proliferation of LLC by cell long-term dynamic monitoring (, n=6)   下载原图
 
 
图3 IFN-γ诱导LLC细胞PD-L1表达的浓度筛选 (, n=3) Fig.3 Concentration screening of PD-L1 expression in LLC cells induced by IFN-γ (, n=3)  
图3 IFN-γ诱导LLC细胞PD-L1表达的浓度筛选 (, n=3) Fig.3 Concentration screening of PD-L1 expression in LLC cells induced by IFN-γ (, n=3)   下载原图
 
 
与对照组比较:***P<0.001***P<0.001 vs control group
 
图4 人参皂苷Rg3对LLC细胞表面PD-L1表达的影响 (, n=3, 免疫荧光) Fig.4 Effects of ginsenoside Rg3 on PD-L1 expression of LLC cells (, n=3, immunofluorescence)  
图4 人参皂苷Rg3对LLC细胞表面PD-L1表达的影响 (, n=3, 免疫荧光) Fig.4 Effects of ginsenoside Rg3 on PD-L1 expression of LLC cells (, n=3, immunofluorescence)   下载原图
 
 
与对照组比较:***P<0.001;与模型组比较:##P<0.01###P<0.001***P<0.001 vs control group;##P<0.01###P<0.001 vs model group
 
图5 人参皂苷Rg3对LLC细胞表面PD-L1表达的影响 (, n=3, 流式细胞术) Fig.5 Effects of ginsenoside Rg3 on PD-L1 expression of LLC cells (, n=3, flow cytometry)  
图5 人参皂苷Rg3对LLC细胞表面PD-L1表达的影响 (, n=3, 流式细胞术) Fig.5 Effects of ginsenoside Rg3 on PD-L1 expression of LLC cells (, n=3, flow cytometry)   下载原图
 
 
与对照组比较:***P<0.001;与模型组比较:#P<0.05###P<0.001***P<0.001 vs control group;#P<0.05###P<0.001 vs model group
 
3.4 人参皂苷Rg3对PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白表达的影响
 
 
进一步研究人参皂苷Rg3的作用机制, 由于PI3K/Akt/mTOR信号通路与PD-L1表达存在关联。因此检测肿瘤细胞中PI3K、m TOR、Akt、p-Akt的表达情况。Western blotting结果表明 (图6) , 人参皂苷Rg3 16μmol/L组细胞p-Akt表达水平显著降低 (P<0.05) ;人参皂苷Rg3 32μmol/L组细胞m TOR、PI3K、p-Akt表达显著降低 (P<0.05、0.01) ;人参皂苷Rg3 64μmol/L组细胞m TOR、PI3K、p-Akt表达显著降低 (P<0.01、0.001) ;各浓度下人参皂苷Rg3均不显著影响细胞Akt表达。人参皂苷Rg3可能通过下调PI3K、m TOR表达, 抑制Akt活化, 从而阻断PI3K/Akt/m TOR信号通路, 进一步降低LLC表面PD-L1表达, 阻断肿瘤细胞逃避免疫应答。
 
4 讨论
 
 
在传统中医学中, 人参具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺等功效[7]。人参中有效活性成分人参皂苷在调节免疫方面的作用尤为显著。现代药理学研究发现, 人参皂苷通过以下方式影响机体免疫系统:通过保护固有免疫器官胸腺、脾脏、淋巴结等发挥抗病毒作用;增强树突状细胞、吞噬细胞、NK细胞等固有免疫细胞的免疫应答, 杀伤病毒感染细胞及肿瘤细胞;调节细胞因子、补体等免疫分子产生免疫调节效应[8,9,10]。人参中含有近50种人参皂苷成分, 其中多种成分均具有显著的抑制肿瘤细胞增殖、转移的作用。人参皂苷Rg3为四环三萜类原人参二醇型皂苷, 存在2种构型, 分别为20 (S) -型和20 (R) -型, 其中20 (S) -型Rg3具有显著抗肿瘤效应, 是众多R型人参皂苷中调节免疫和抗肿瘤作用最显著的有效成分[11]。
 
图6 人参皂苷Rg3对LLC细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达的影响 (, n=3) Fig.6 Effects of ginsenoside Rg3 on protein expression of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway (, n=3)  
图6 人参皂苷Rg3对LLC细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达的影响 (, n=3) Fig.6 Effects of ginsenoside Rg3 on protein expression of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway (, n=3)   下载原图
 
 
与对照组比较:*P<0.05**P<0.01***P<0.001*P<0.05**P<0.01***P<0.001 vs control group
 
 
PD-L1表达于多种肿瘤细胞表面, 其与T细胞上的PD-1相结合后, 导致T细胞失活, 无法杀伤肿瘤细胞, 最终诱导免疫逃逸。NSCLC是最具攻击性和破坏性的恶性肿瘤之一。在NSCLC实体瘤中常见PD-L1过度表达, 虽然PD-L1作为肺癌的生物标志物还存在争议, 但是肿瘤细胞发生免疫逃逸的微环境中PD-L1的高表达值得关注[12,13]。免疫应答微环境涉及多种信号调节, 包括信号传导及转录激活因子STAT3、Akt/mTOR或编码RAF家族丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶BRAF的突变[14,15]。PD-L1的调节是复杂的, 取决于潜在的转录和信号转导网络状态以及蛋白翻译水平。PI3K/Akt/mTOR信号通路是多种细胞过程中的重要调节因子, 在70%的NSCLC病例中发生Akt/m TOR过度活化[16]。因此, PI3K/Akt/m TOR通路与PD-L1存在紧密关联, 抑制PI3K/Akt/m TOR通路能够抑制PD-L1表达, 阻断肿瘤细胞免疫逃逸。
 
 
目前, 人参皂苷Rg3对PD-L1的作用研究较少。本研究通过MTT法及长时程动态监测验证人参皂苷Rg3可显著抑制LLC增殖。流式细胞术及免疫荧光结果显示人参皂苷Rg3调控IFN-γ诱导的PD-L1高表达。并且免疫印迹结果表明该作用通过PI3K/Akt/mTOR通路介导, 从而增强T细胞的肿瘤细胞杀伤作用, 抑制LLC增殖。本研究从免疫检查点PD-L1角度揭示了人参皂苷Rg3调节免疫、抗肿瘤的作用, 为相关新药的研究提供了依据。
 
 
然而, 本研究仅涉及体外实验部分。后续实验将对照人参皂苷Rg3对免疫正常小鼠以及免疫缺陷裸鼠的LLC移植瘤模型的影响进行体内验证, 以及对人参皂苷增强T细胞活力的具体机制进行深入研究, 以阐明人参皂苷Rg3通过调节免疫检查点PD-L1抑制NSCLC发生发展的机制。
 

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文章名称:人参皂苷Rg3调节免疫检查点PD-L1抑制肺癌Lewis细胞增殖的作用及机制研究

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