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4种细胞毒活性方法评价紫草素体外肿瘤细胞抑制作用效果

分类:(二) 发表时间:2019-08-18

四甲基偶氮唑盐 (MTT) 法是1983年由Mosmann提出的用于快速测量细胞增殖、细胞活性及细胞毒性的方法[1], 因其价格低廉, 简单灵敏而被广泛应用于抗肿瘤药物筛选。台盼蓝拒染法 (trypan bl
 
四甲基偶氮唑盐 (MTT) 法是1983年由Mosmann提出的用于快速测量细胞增殖、细胞活性及细胞毒性的方法[1], 因其价格低廉, 简单灵敏而被广泛应用于抗肿瘤药物筛选。台盼蓝拒染法 (trypan blue exclusion test, TBEX) 是检测体外培养细胞存活率的常用方法。磺酰罗丹明B (sulforhodamine B, SRB) 法是美国国立肿瘤研究所 (NCI) 认可的标准抗肿瘤筛选方法[2], SRB与细胞内组成蛋白质的碱性氨基酸结合来标示细胞增殖情况, 因无操作时间限制而用于高通量药物筛选。Cell counting kit-8 (CCK-8) 法因操作简便、准确度和灵敏度高而被广泛使用[3], WST-8在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯 (1-methoxy PMS) 存在的情况下被细胞内脱氢酶还原成水溶性的甲臜, 并与活细胞数量成正比。CCK-8法是MTT法的升级版, SRB法常用于与MTT法互相验证。在长期使用MTT比色法过程中, 发现MTT可能与化学试剂发生反应, 药物对线粒体功能产生影响也会干扰药物的药效[4], 色素类受试物可能会干扰MTT的检测效率。
 
 
以紫草萘醌为代表的天然色素有凉血、活血、清热、解毒的功能, 其中紫草素及其衍生物已被证实有抗菌、抗炎和抗肿瘤的药理作用[5,6]。在前期的文献检索和对比中发现紫草素的细胞毒活性差异较大[7,8,9,10,11,12,13,14], MTT法的半数抑制浓度 (IC50) 结果偏高, 认为萘醌色素可能对MTT法的结果存在干扰。本研究以紫草素高敏感株急性早幼粒白血病HL-60细胞和其低敏感株人非小细胞肺癌A549细胞为模型, 选取最常用的TBEX法、SRB法、CCK-8法和MTT比色法展开对比研究。
 
1 材料
 
1.1 细胞
 
 
HL-60细胞购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库, A549细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所。
 
1.2 药物与试剂
 
 
紫草素 (批号SLBL2993V, 质量分数≥98%) 、台盼蓝 (批号620C058) 和SRB (批号05605DC) 试剂盒均购自美国Sigma公司;胎牛血清购自美国Biological Industries公司;IMDM培养基和DMEM-F12培养基购自Gibco公司;CCK-8试剂盒购自日本同仁化学公司;MTT试剂盒购自北京索莱宝公司。
 
1.3 仪器
 
 
Thermo 3131 CO2细胞培养箱购自美国Thermo公司;ZHJH 1112B超净工作台购自上海智城分析仪器制造有限公司;BDS200-PH倒置生物显微镜购自重庆奥特光学仪器有限公司;Thermo VarioFlash3001多功能酶标仪购自美国Thermo公司。
 
2 方法
 
2.1 细胞培养
 
 
HL-60细胞用含20%胎牛血清、100 kU/L青霉素及100 mg/L链霉素的IMDM培养液 (pH 7.5) 在37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养, 取对数生长期细胞进行实验。A549细胞使用含10%胎牛血清、100 kU/L青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM-F12培养液于37℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养, 取对数生长期细胞进行实验。
 
2.2 TBEX法测定细胞抑制率
 
 
取对数生长期的细胞用完全培养液调整细胞浓度为2×105个/mL, 接种于24孔板内, 每孔1 mL, 设对照组和紫草素各浓度组。HL-60细胞分别加入0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8μmol/L的紫草素, A549细胞加入4、8、16、32、64、128μmol/L的紫草素, 每组设6个平行孔。在37℃、5%CO2、饱和湿度下培养24 h后收集细胞, 经0.4%台盼蓝染色后, 拍照并计数活细胞, 计算细胞抑制率[15]。
 
 
 
 
2.3 MTT法测定细胞抑制率
 
 
取对数生长期的细胞用完全培养液调整细胞浓度为4×104个/mL, 96孔培养板每孔接种200μL, 分组及给药同“2.2”项下, 每组设6个复孔, 37℃培养24 h。每孔加入20μL MTT溶液 (5 g/L) , 继续培养4 h, 悬浮细胞1 000 r/min离心10 min弃上清, 贴壁细胞直接弃上清后, 加入150μL DMSO, 振荡10 min, 酶标仪检测570 nm处吸光度 (A) 值, 并根据公式计算抑制率[16]。
 
 
 
 
2.4 SRB法测定细胞抑制率
 
 
取对数生长期的细胞用完全培养液调整细胞浓度为4×104个/mL, 96孔培养板每孔接种200μL, 分组及给药同“2.2”项下, 每组设6个复孔, 37℃培养24 h后终止培养。贴壁细胞每孔轻柔加入50μL经4℃预冷的500 mL/L三氯醋酸, 静置5 min, 4℃固定l h。去固定液, 用二次蒸馏水冲洗5遍, 自然晾干。悬浮细胞每孔轻柔加入50μL经4℃预冷的800 mL/L三氯醋酸, 静置5 min, 4℃固定1 h, 余同贴壁细胞。干燥后, 每孔加入4 mg/mL SRB溶液100μL, 室温下染色10 min, 弃上清, 用1%乙酸冲洗5遍以去除非特异性结合的染料。自然晾干后每孔加入150μL DMSO, 酶标仪检测490 nm处A值, 并计算抑制率[17], 计算方法同“2.3”项下。
 
2.5 CCK-8法测定细胞抑制率
 
 
取对数生长期的细胞用完全培养液调整细胞浓度为4×104个/mL, 96孔培养板每孔接种100μL, 设对照组、实验组及空白组, 紫草素浓度同“2.2”项下, 每组6个复孔。37℃培养24 h后终止培养, 每孔加入10μL CCK-8溶液, 37℃孵育3 h后, 酶标仪检测450 nm处的A值, 计算细胞抑制率[18]:
 
 
 
 
2.6 甲臜和紫草素的最强吸收范围比较
 
 
取对数生长期的细胞接种于96孔板, 细胞浓度1×104个/mL, 每孔加入细胞悬液100μL。甲臜组每孔加入100μL培养液, 紫草素组每孔加入100μL12.8μmol/L紫草素, 设6个复孔, 培养24 h后加入MTT溶液10μL, 37℃培养4 h, 弃上清, 加入150μL DMSO。用酶标仪在波长400~600 nm进行全波长扫描, 测量最强吸收范围。
 
 
检测紫草素本底A值对MTT结果的影响, 取对数生长期的细胞接种于96孔板, 细胞浓度为1×104个/mL, 每孔加入细胞悬液100μL。对照组每孔加入100μL培养液;紫草素给药组每孔加入12.8μmol/L紫草素100μL;紫草素预处理组加入12.8μmol/L的紫草素100μL预处理2 h后洗去药物, 加入150μL DMSO;紫草素本底组不加细胞, 加入12.8μmol/L紫草素 (PBS稀释) 100μL。每组设6个复孔, 培养24 h后前2组每孔加入10μL MTT溶液 (5g/L) , 37℃培养4 h, 弃上清, 加入150μL DMSO, 振荡10 min, 酶标仪检测570 nm处A值。
 
2.7 统计学方法
 
 
采用SPSS 19.0软件进行统计分析, 数据均用表示, 多组均数间比较用单因素方差分析, 两组间差异比较采用t检验。
 
3 结果
 
3.1 TBEX法、SRB法、CCK-8法和MTT法检测紫草素对HL-60细胞增殖的影响
 
 
TBEX法、SRB法、CCK-8法和MTT法检测得到紫草素对HL-60细胞的IC50分别为0.57、0.77、1.36、1.01μmol/L, 紫草素浓度在3.2μmol/L以下时, 4种方法抑制率曲线均呈线性增长, 但CCK-8法所得抑制率明显低于其余3种方法。紫草素浓度高于3.2μmol/L, TBEX法与SRB法抑制率曲线仍呈上升趋势且没有显著性差异, 而MTT法与CCK-8结果出现差异, 抑制率上升趋势减弱甚至下降 (图1) 。在紫草素12.8μmol/L时, CCK-8法测得最大抑制率为81%, 而TBEX法最大抑制率为96%。4种方法线性比较为SRB法>TBEX法>MTT法>CCK-8法 (表1) 。
 
3.2 TBEX法、SRB法、CCK-8法和MTT法检测紫草素对A549细胞增殖的影响
 
 
TBEX法、SRB法、CCK-8法和MTT法检测得到紫草素对A549细胞的IC50分别为6.30、10.38、13.48、15.24μmol/L, 紫草素浓度在32μmol/L以下时, 4种方法抑制率均呈线性上升, 但MTT法与CCK-8法所得抑制率明显低于TBEX法与SRB法。紫草素浓度高于32μmol/L, TBEX法与SRB法细胞抑制率仍呈上升趋势且没有显著性差异, 而MTT法与CCK-8法结果出现差异, 抑制率上升趋势减弱甚至下降 (图2) 。在紫草素128μmol/L时, MTT法测得细胞抑制率为89%, 而TBEX法所得细胞抑制率为99%。4种方法线性比较为SRB法>TBEX>MTT法>CCK-8法 (表2) 。
 
图1 紫草素作用HL-60细胞24 h抑制率曲线 (, n=6) Fig.1 Inhibitory rate curve of shikonin on HL-60 cells after24 h treatment (, n=6)  
图1 紫草素作用HL-60细胞24 h抑制率曲线 (, n=6) Fig.1 Inhibitory rate curve of shikonin on HL-60 cells after24 h treatment (, n=6)   下载原图
 
 
与TBEX法比较:**P<0.01**P<0.01 vs TBEX group
 
 
表1 4种方法的线性及IC50比较 (HL-60细胞) Table 1 Linear and IC50 comparison of four methods (HL-60 cells)     下载原表 
表1 4种方法的线性及IC50比较 (HL-60细胞) Table 1 Linear and IC50 comparison of four methods (HL-60 cells)  
3.3 甲臜和紫草素最强吸收范围
 
 
在400~600 nm波长内, 甲臜和紫草素的吸收峰部分重叠, 说明紫草素本底A值可能影响到实验结果, 使检测到的甲臜A值偏大, 导致MTT法测得的抑制率偏低 (图3) 。为了证明紫草素本底A值是否会影响MTT结果, 使用紫草素12.8μmol/L预处理HL-60细胞2 h后洗去药物, 加DMSO裂解细胞, 在二者重叠的最强吸收波长570 nm处检测A值, 检测结果与MTT法测得A值和紫草素本底A值没有显著性差异, 说明高浓度紫草素会影响MTT实验结果, 使测得甲臜A值增加 (图4) 。
 
图2 紫草素作用A549细胞24 h抑制率曲线 (, n=6) Fig.2 Inhibitory rate curve of shikonin on A549 cells after24 h treatment (, n=6)  
图2 紫草素作用A549细胞24 h抑制率曲线 (, n=6) Fig.2 Inhibitory rate curve of shikonin on A549 cells after24 h treatment (, n=6)   下载原图
 
 
与TBEX法比较:**P<0.01**P<0.01 vs TBEX group
 
 
表2 4种方法的线性及IC50比较 (A549细胞) Table 2 Linear and IC50 comparison of four methods (A549cells)     下载原表 
表2 4种方法的线性及IC50比较 (A549细胞) Table 2 Linear and IC50 comparison of four methods (A549cells)  
3.4 TBEX法染色结果
 
 
在HL-60和A549细胞中, 分别用12.8μmol/L和128μmol/L紫草素干预, 细胞几乎完全被杀死, 板孔内只有被台盼蓝染色的死细胞, 相比对照组差异显著, 说明此处检测到的A值不能代表细胞的数量 (图5) 。
 
图3 甲臜与紫草素最强紫外吸收范围 (, n=6) Fig.3 Strongest absorption range of formazan and shikonin (, n=6)  
图3 甲臜与紫草素最强紫外吸收范围 (, n=6) Fig.3 Strongest absorption range of formazan and shikonin (, n=6)   下载原图
 
 
图4 12.8μmol/L紫草素在波长570 nm处对MTT结果的影响 (, n=6) Fig.4 Effect of 12.8μmol/L shikonin on MTT at wavelength of 570 nm (, n=6)  
图4 12.8μmol/L紫草素在波长570 nm处对MTT结果的影响 (, n=6) Fig.4 Effect of 12.8μmol/L shikonin on MTT at wavelength of 570 nm (, n=6)   下载原图
 
 
图5 HL-60与A549细胞台盼蓝拒染法镜下观察结果Fig.5 Picture of trypan blue exclusion method in HL-60and A549 cells  
图5 HL-60与A549细胞台盼蓝拒染法镜下观察结果Fig.5 Picture of trypan blue exclusion method in HL-60and A549 cells   下载原图
 
 
4 讨论
 
 
目前广泛使用的测定细胞活力的方法均是间接法, 通过捕捉固定时间点细胞内某个酶的催化性指标来反映细胞活力。MTT法是最常用的细胞毒活性检测方法, 在长期使用过程中, Peng等[19]发现类黄酮化合物如木犀草素和槲皮素可以在不存在细胞的情况下与MTT反应。Stepanenko等[20]发现受药物处理介导的应激、抑制剂非靶效应的细胞适应性代谢及线粒体重编程会导致MTT法高估或低估细胞活力;Wang等[21]发现以MTT和3- (4, 5-二甲基吡啶-2-基) -5- (3-羧基甲氧基苯基) -2- (4-磺苯基) -2h-四唑盐 (MTS) 为基础的检测将低估表没食子儿茶素没食子酸酯 (EGCG) 的抗增殖作用。这些研究中, 不适用MTT法的药物如类黄酮化合物、EGCG茶多酚等均属于有色化合物, 紫草萘醌类天然色素也属于有色化合物。这些有色化合物在高浓度时会从培养液中析出, 也可能蓄积在细胞内。以往的体外研究表明, 紫草素对不同敏感性和各种状态的肿瘤细胞均有生长抑制作用[6,7]。然而在使用MTT法检测细胞毒活性时, 紫草素对同种细胞的IC50值范围较广, 其对HL-60细胞的IC50值为0.35~5.5μmol/L[7,8,9,10,11], 对A549细胞的IC50值为1.75~12.79μmol/L[6,12,13,14], 差异悬殊。
 
 
通过4种常用的细胞毒活力检测方法分析可知, 对于HL-60细胞, MTT法和CCK-8法所得IC50明显大于其余2种方法, 紫草素浓度大于3.2μmol/L后抑制率变化不明显, CCK-8法检测得到的抑制率明显偏低。CCK-8法因操作简便且稳定性好被广泛用于悬浮细胞毒活性检测, 然而在HL-60细胞中, 紫草素的毒性与试剂协同作用导致整体抑制率更低, 说明CCK-8法不适用于紫草素对HL-60细胞的细胞毒活性检测。在A549细胞中, MTT法所得的IC50值明显大于其余3种方法, 在紫草素浓度为128μmol/L时抑制率明显小于TBEX结果, 此外MTT法和CCK-8法所得抑制率曲线在紫草素浓度大于32μmol/L后抑制率增长趋势减弱, 而TBEX和SRB法结果一致性较好, 抑制率曲线呈线性增长。MTT法是通过测量细胞内琥珀酸脱氢酶催化指标甲臜的A值来反映细胞活力, 甲臜的蓝紫色与紫草素的紫色非常接近, 通过定波长扫描发现二者的最强吸收峰有部分重叠。使用紫草素12.8μmol/L预处理HL-60细胞2 h后洗去药物, 在重叠波长570nm处检测A值, 发现其与紫草素本底A值以及MTT检测结果没有显著性差异, 因此在MTT实验时, 测得的A值是甲臜的A值和孔板内紫草素的A值之和, 这就是同一体系测得的紫草素IC50值不同且偏高的原因。
 
 
本研究结果表明, 紫草素与MTT法所测指标甲臜的颜色相近, 吸收峰部分重叠, 在低浓度紫草素的干预下, MTT法所测得的A值会增加。在高浓度紫草素作用下几乎没有活细胞, 但在没有加入MTT试剂前板孔中仍有蓝紫色试剂检出, 认为是进入细胞的紫草素而非甲臜, 使得MTT法测量紫草素抗肿瘤药效时IC50普遍偏高;同时在紫草素高敏感株HL-60细胞中CCK-8会和紫草素协同作用使检测A值增加。因此在进行有色药物的抗肿瘤筛选实验时, 要注意有色药物颜色与检测背景里生成的有色物质的颜色差异和试剂的影响, 避免药物颜色和试剂毒性对检测结果的影响。
 

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文章名称:4种细胞毒活性方法评价紫草素体外肿瘤细胞抑制作用效果

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