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灰毡毛忍冬LmPAL1基因的克隆及表达分析

分类:(二) 发表时间:2019-08-18

灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.来源于为忍冬科 (Caprifoliaceae) 忍冬属Lonicera Linn.半常绿缠绕藤本植物, 归于山银花项下, 具有清热解毒、疏散风热的功效[1]。绿原酸 (chlorogenic acid,
 
灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.来源于为忍冬科 (Caprifoliaceae) 忍冬属Lonicera Linn.半常绿缠绕藤本植物, 归于山银花项下, 具有清热解毒、疏散风热的功效[1]。绿原酸 (chlorogenic acid, CGA) 是灰毡毛忍冬的主要活性成分, 且含量较高, 现代研究表明绿原酸具抗氧化、抗高血压、抗菌、抗肿瘤、抗辐射、降血糖、调血脂、抗炎、补肾、保肝等多种药理作用[2], 医药、化工和食品等领域对绿原酸均有广泛需求[3], 应用前景广阔, 绿原酸生物合成途径及相关关键基因的研究成为目前的研究热点。
 
 
绿原酸是由咖啡酸的1位羧基和奎尼酸的3位羟基缩合成酯的天然产物[3], 是重要的植物苯丙素类次生代谢产物之一, 最初由L-苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶 (phenylalanine ammonia-lyase, PAL) 作用下生成反式肉桂酸, 然后在肉桂酸-4羟化酶 (cinnamate4-hydroxylase, C4H) 和4-香豆酸连接酶 (4-coumarate Co A ligase, 4CL) 作用下生成对-香豆酰辅酶A, 最后在羟基肉桂酰辅酶A奎尼酸羟基肉桂酰转移酶 (hydroxycinnamoyl-Co A quinate hydroxycinnamoyl transferase, HQT) 作用下生成绿原酸[4]。目前有研究者已对忍冬[4]、杜仲[5]、枸杞[6]、黑三棱[7]、细辛[8]、姜黄[9]、当归[10]等植物进行PAL基因克隆、生物信息学及表达模式分析相关研究, PAL主要在植物抗病和抗逆防御等过程中发挥着重要的作用[11], 同时与绿原酸含量的积累密切相关[12]。
 
 
查阅文献和NCBI数据库发现, NCBI中有上传灰毡毛忍冬PAL1部分核心序列, 仅493个碱基, 编码164个氨基酸, 目前无灰毡毛忍冬PAL1基因全长克隆相关报道。本研究以灰毡毛忍冬花为材料, 通过前期灰毡毛忍冬转录组数据中Unigene序列设计引物, 利用RT-PCR和RACE技术, 克隆灰毡毛忍冬PAL1 (LmPAL1) 基因的全长cDNA序列, 并进行生物信息学分析, 运用实时荧光定量PCR (qRT-PCR) 对灰毡毛忍冬不同花期和不同器官进行表达模式分析, 为进一步通过基因工程技术提高灰毡毛忍冬绿原酸含量、优选种质资源奠定基础, 同时也为完善绿原酸生物合成途径和调节机制研究提供实验数据。
 
1 材料和试剂
 
 
灰毡毛忍冬种于湖南中医药大学药植园, 于2018年5月下旬采收当年生新鲜茎、叶及7个不同花期 (花蕾初期、青绿色花期、绿白色花蕾期、白色花蕾期、白色开花期、金黄色开花期、枯萎期) 花样品, 用装有液氮的泡沫盒运回实验室, 经湖南中医药大学周日宝教授鉴定为灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.的茎、叶、花, 保存于-80℃超低温冰箱。
 
 
多糖多酚植物总RNA提取试剂盒 (杭州博日科技有限公司) ;RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒 (Thermo公司) ;快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、2×Taq MasterMix (Dye) 、2×Pfu MasterMix (Dye) (康为世纪生物科技有限公司) ;pEASY®-T1 Cloning Vector、pEASY®-Blunt Cloning Vector、TranStart®Green qPCR SuperMix UDG (北京全式金生物科技有限公司) ;RACE试剂盒 (SMARTer®RACE5’/3’Kit, Clontech公司) 。引物序列见表1, 由上海生工生物工程股份有限公司合成, 引物浓度均为10μmol/L。
 
 
表1 引物序列Table 1 Primer sequences     下载原表 
表1 引物序列Table 1 Primer sequences  
2 方法
 
2.1 LmPAL1基因的克隆
 
2.1.1 总RNA提取和cDNA合成
 
 
取适量灰毡毛忍冬白色花蕾期花, 按照多糖多酚植物总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA[13], 用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性, 核酸蛋白分析仪检测RNA的纯度。将质量较好的RNA, 参照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit说明书, 逆转录合成c DNA的第一链。
 
2.1.2 LmPAL1基因核心片段扩增
 
 
根据本课题组前期转录组测序结果, 选取注释为苯丙氨酸解氨酶的序列, 应用Primer Premier 5.0设计特异性引物PAL1-F和PAL1-R (表1) , 以逆转录得到的c DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系 (25μL) :ddH2O 9.5μL, 2×Taq MasterMix (Dye) 12.5μL, c DNA 1μL, PAL1-F和PAL1-R各1μL。PCR反应条件:94℃预变性2 min;94℃变性30 s, 60℃退火30 s, 72℃延伸1 min, 循环35次;72℃终延伸10 min, 4℃保存。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测, 切下目的条带, 快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收, 以pEASY®-T1 Cloning Vector为载体, 与目的基因连接, 转化至感受态细胞中, 通过含有X-gal、IPTG、Amp的LB固体培养基进行蓝白斑筛选, 挑选白斑进行菌落PCR, 将阳性克隆接种于含有Amp的LB液体培养基中过夜培养, 委托铂尚生物技术有限公司测序。
 
2.1.3 LmPAL1基因3’和5’端RACE扩增
 
 
根据“2.1.2”项核心片段测序结果, 设计RACE特异性引物PAL1-3’和PAL1-5’ (表1) , 首先按照Clontech公司SMARTer®RACE5’/3’Kit试剂盒说明书, 获得LmPAL1基因的5’-和3’-RACE-Ready c DNA, 用Tricine-EDTA Buffer稀释。PCR反应体系 (50μL) :PCR-Grade H2O 15.5μL, 2×SeqAmp Buffer 25μL, SeqAmp DNA Polymerase 1.0μL, 5’或3’-RACE-Ready cDNA 2.5μL, 10×UPM 5μL, 5’-或3’引物1μL。PCR反应条件:94℃、30 s, 72℃2 min, 5个循环;94℃、30 s, 70℃、30 s, 72℃、2 min, 5个循环, 94℃、30 s, 68℃、30 s, 72℃、2 min, 25个循环。扩增目的条带回收和测序等过程同“2.1.2”项, 其中载体使用p EASY®-Blunt Cloning Vector。
 
2.1.4 LmPAL1基因c DNA全长序列验证
 
 
利用Conting Express对3’端和5’端进行序列拼接, 得到LmPAL1基因的c DNA全长, 根据拼接全长设计c DNA全长验证引物V-PAL1-F和V-PAL1-R (表1) , 以“2.1.1”项下c DNA为模板进行全长验证。反应体系 (25μL) :ddH2O 9.5μL, 2×Pfu MasterMix (Dye) 12.5μL, c DNA 1μL, V-PAL1-F和V-PAL1-R各1μL。PCR反应条件:94℃预变性2 min;94℃变性30 s, 60℃退火30 s, 72℃延伸3 min, 循环35次;72℃终延伸5 min, 4℃保存。扩增目的条带回收和测序等过程同“2.1.2”项, 其中载体使用pEASY®-Blunt Cloning Vector。
 
2.2 生物信息学分析
 
 
采用NCBI在线软件“ORF finder” (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/) 查找HQT的开放阅读框, 通过在线软件Prot Param (https://web.expasy.org/protparam/) 预测蛋白结构, 分析目的基因编码蛋白质的氨基酸组成、蛋白质相对分子质量、理论等电点及稳定性等参数;采用Prot Scale软件 (http://web.expasy.org/protscale/) 测定蛋白亲/疏水性;WOLF PSORT (http://www.genscript.com/wolf-psort.html) 在线预测蛋白质亚细胞定位情况;TMHMM 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) 进行蛋白质跨膜结构分析;SignalP 4.1Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 预测信号肽;Inter Pro Scan (http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search) 分析蛋白质结构域;SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html) 和SWISS-MODEL (https://www.swissmodel.expasy.org/) 软件分别预测蛋白质的二级结构和三级结构;通过NCBI的蛋白质序列数据库进行BLAST, 筛选出同源性较高的物种, 利用DNAMAN软件进行氨基酸多重序列比对, MEGA 7软件构建系统进化树。
 
2.3 LmPAL1基因的组织表达水平分析
 
 
根据LmPAL1基因全长序列, 设计qRT-PCR的特异性引物Q-PAL1-R和Q-PAL1-F (表1) , 以18 S rRNA为内参基因[14,15]。按照“2.1.1”项方法提取灰毡毛忍冬茎、叶和7个不同花期花的总RNA, 将RNA定量后, 反转录成c DNA, 进行实时荧光定量分析。反应体系 (20μL) :TranStart®Green qPCR SuperMix UDG 10μL, c DNA 1μL, Q-PAL1-R和Q-PAL1-F各0.4μL, ddH2O 8.2μL。反应条件:50℃、2 min, 94℃、10 min;94℃、5s, 55℃、15 s, 72℃、10 s, 40个循环, 做熔解曲线分析, 每个样品重复3次, 实验在Bio-Rad CFX96上进行, 采用2-ΔΔCt计算基因的相对表达量。
 
3 结果与分析
 
3.1 LmPAL1基因的克隆
 
3.1.1 总RNA的提取
 
 
灰毡毛忍冬花的总RNA琼脂糖凝胶电泳见图1, 可见28 S和18 S条带明显, 其中28 S条带亮度是18 S的2倍, 说明RNA完整性较好, A260/A280值在1.8~2.0, A260/A230值大于2.0, RNA质量符合后续实验要求。
 
图1 总RNA琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA  
图1 总RNA琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA   下载原图
 
 
3.1.2 LmPAL1核心片段扩增
 
 
通过转录组Unigene序列设计引物, 利用RT-PCR扩增得到单一条带, 约为1 100 bp (图2) , 经过回收、纯化、克隆、测序后, 获得该片段序列为1 163 bp, 通过DNAMAN比对, 与转录组测序结果一致, 相似度达100%。
 
图2 Lm PAL1基因核心片段扩增产物Fig.2 PCR product core fragment of Lm PAL1 gene  
图2 Lm PAL1基因核心片段扩增产物Fig.2 PCR product core fragment of Lm PAL1 gene   下载原图
 
 
3.1.3 LmPAL1基因全长cDNA的获得
 
 
根据核心片段序列设计RACE特异性引物, 分别进行5’端和3’端扩增。3’端在1 463 bp左右出现一条亮带, 5’端在1 167 bp左右出现一条亮带。将亮带切下胶回收, 转化至载体上, 挑选阳性克隆测序, 将3’端、5’端和核心片段序列进行拼接, 获得LmPAL1基因cDNA全长序列2 549 bp (图3) 。设计全长验证引物, 以“2.1.1”项下的cDNA为模板进行PCR扩增, 在2 500 bp左右有明显单一亮带, 将亮带回收、纯化、克隆、测序, 测序结果与拼接全长序列一致, 说明成功克隆出LmPAL1基因的cDNA全长。
 
图3 Lm PAL1基因全长c DNA的扩增Fig.3 PCR product of full-length c DNA from LmPAL1 gene  
图3 Lm PAL1基因全长c DNA的扩增Fig.3 PCR product of full-length c DNA from LmPAL1 gene   下载原图
 
 
M-Marker 1-3’RACE扩增产物2-5’RACE扩增产物3-全长c DNA扩增产物M-Marker 1-3’RACE product 2-5’RACE product 3-full-length cDNA
 
3.2 LmPAL1基因生物信息学分析
 
3.2.1 LmPAL1蛋白理化特性
 
 
LmPAL1基因全长2 549 bp, 3’端非编码区202 bp, 带有30 bp的ployA尾, 5’端非编码区202 bp, 中间具有完整的开放阅读框2 145 bp, 该序列编码氨基酸714个, 碱基和氨基酸序列见图4。将其上传至NCBI数据库并命名为LmPAL1, GenBank登录号为MH236488。利用ExPASy ProtParam在线软件对LmPAL1基因编码蛋白的理化性质进行预测分析, 推测其分子式为C3420H5482N950O1043S29, 相对分子质量为77 526.63, 等电点为6.04, 预测其在哺乳动物体内半衰期为30 h, 在酵母中的半衰期大于20 h, 不稳定系数为35.26<40, 属于稳定蛋白, 带正电残基 (Arg+Lys) 为73, 带负电残基 (Asp+Glu) 为83, 脂肪系数91.25, 亲水性平均系数为-0.146, ProtScale进行蛋白亲水/疏水性分析 (图5) , 预测其为亲水性蛋白。
 
 
WOLF PSORT预测Lm PAL1蛋白可能定位于叶绿体中。运用在线软件TMHMM分析, 发现该基因编码的氨基酸1~714全部在膜外, 不具有跨膜区域。Signal P 4.1 Server进行信号肽预测分析, 发现Lm PAL1不具有信号肽序列, 推测其不是分泌蛋白。
 
图4 Lm PAL1全长序列及推测的氨基酸序列Fig.4 Full-length c DNA sequence of LmPAL1 gene and predicted amino acid sequence  
图4 Lm PAL1全长序列及推测的氨基酸序列Fig.4 Full-length c DNA sequence of LmPAL1 gene and predicted amino acid sequence   下载原图
 
 
图5 Lm PAL1基因所编码蛋白亲疏水性分析Fig.5 Hydrophobicity analysis of Lm PAL1 encoding protein  
图5 Lm PAL1基因所编码蛋白亲疏水性分析Fig.5 Hydrophobicity analysis of Lm PAL1 encoding protein   下载原图
 
 
3.2.2 Lm PAL1蛋白结构域和二、三级结构
 
 
Inter Pro对Lm PAL1蛋白结构域进行预测, 结果 (图6) 显示, 该蛋白属于苯丙氨酸解氨酶家族, 包含PAL shielding结构域 (527~641 aa) , 此外N端含有延胡索酸酶/组氨酸结构域 (17~260 aa) , 并且含有PAL/HAL (苯丙氨酸解氨酶和组氨酸解氨酶) 活性中心序列GTITASGDLVPLSYIAG (196~212 aa) 。利用SOPMA软件对LmPAL1蛋白的二级结构进行预测 (图7) , 该蛋白组成为α-螺旋 (alpha helix, 54.90%) 392处、随机卷曲 (random coil, 30.67%) 219处, 延伸链 (extended strand, 8.26%) 59处以及β转角 (beta turn, 6.16%) 44处, α-螺旋和随机卷曲为该蛋白二级结构的主要元件。运用SWISS-MODEL建模工具在线预测LmPAL1蛋白的三级结构, 见图8。
 
图6 Lm PAL1结构域Fig.6 Lm PAL1 domain  
图6 Lm PAL1结构域Fig.6 Lm PAL1 domain   下载原图
 
 
图7 Lm PAL1的二级结构预测Fig.7 Secondary structure prediction of Lm PAL1  
图7 Lm PAL1的二级结构预测Fig.7 Secondary structure prediction of Lm PAL1   下载原图
 
 
蓝色代表α-螺旋, 红色代表延伸链, 绿色代表β-转角, 紫色代表随机卷曲Blue, red, green and purple stand for alpha helix, extended strand, beta turn and random coil, respectively
 
图8 Lm PAL1的三维结构预测Fig.8 Three-dimensional structure prediction of Lm PAL1  
图8 Lm PAL1的三维结构预测Fig.8 Three-dimensional structure prediction of Lm PAL1   下载原图
 
 
3.2.3 LmPAL1氨基酸序列同源性比对和系统进化树分析
 
 
应用NCBI中的BlastP在线软件, 对LmPAL1氨基酸序列进行同源性搜索, 用DNAMAN进行比对, 结果显示其与忍冬Lonicera japonica Thunb. (AGE10589.1) 、胡萝卜Daucus carota L.var.sativa Hoffm. (BAC56977.1) 、当归Angelica sinensis (Oliv.) Diels (AJW77399.1) 、烟草Nicotiana tabacum L. (NP_001311946.1) 、番茄Lycopersicon esculentum Mill. (NP_001307538.1) 、拟南芥Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (NP_190894.1) 同源性分别为98.74%、87.08%、86.19%、84.44%、84.39%、80.64%。氨基酸多重序列比对结果见图9, 分析发现这些物种均含有GTITASGDLVPLSYIAG酶活性中心序列。
 
图9 Lm PAL1与其他植物PAL蛋白的多序列比对分析Fig.9 Analysis of multiple sequence alignment of Lm PAL1 and other plant PAL proteins  
图9 Lm PAL1与其他植物PAL蛋白的多序列比对分析Fig.9 Analysis of multiple sequence alignment of Lm PAL1 and other plant PAL proteins   下载原图
 
 
框内代表酶活性中心序列characters in the box represent the enzyme activity center
 
 
为研究LmPAL1氨基酸序列与其他植物PAL的进化关系, 在NCBI的BlastP筛选其他21种植物 (均属双子叶植物纲) , 运用MEGA7构建NJ进化树, 结果见图10, 系统进化树主要分为3个大的分支, 灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.与忍冬Lonicera japonica Thunb.、蓖麻Ricinus communis L.、胡萝卜Daucus carota L.var.sativa Hoffm.、莴苣Lactuca sativa L.、向日葵Helianthus annuus L.、茶树Camellia sinensis (L.) O.Ktze.、盐肤木Rhus chinensis Mill.聚为一个大类, 与同科同属的忍冬亲缘关系最近。
 
图1 0 Lm PAL1蛋白的NJ系统进化树Fig.10 Neighbor-joining phylogenetic tree of Lm PAL1proteins  
图1 0 Lm PAL1蛋白的NJ系统进化树Fig.10 Neighbor-joining phylogenetic tree of Lm PAL1proteins   下载原图
 
 
3.3 LmPAL1基因的组织特异性表达
 
 
应用qRT-PCR技术测定不同花期和不同器官LmPAL1基因的表达量结果表明, 不同花期表达模式结果见图11, 金黄色开花期相对表达量最高, 白色花蕾期次之, 与其他花期存在极显著差异 (P<0.01) 。不同器官中表达模式结果见图12, 相对表达量从高到低依次是白色花蕾期花>茎>叶, LmPAL1在花的相对表达量最高, 是茎的3倍, 是叶的6.6倍。
 
4 讨论
 
 
本研究成功克隆灰毡毛忍冬PAL基因, 并命名为LmPAL1, 该基因全长2 549 bp, 具有完整的ORF 2 145 bp, 氨基酸714个, 预测其为亲水性蛋白, 可能定位于叶绿体中。结构域预测该蛋白属于苯丙氨酸解氨酶家族, 并且含有苯丙氨酸解氨酶和组氨酸解氨酶活性中心序列GTITASGDLV-PLSYIA (196~212 aa) 。
 
图1 1 Lm PAL1基因在不同花期中相对表达量Fig.11 Relative expression of Lm PAL1 gene in different flowering stages  
图1 1 Lm PAL1基因在不同花期中相对表达量Fig.11 Relative expression of Lm PAL1 gene in different flowering stages   下载原图
 
 
**表示与花蕾初期比较差异性极显著 (P<0.01) **indicates that the difference is very significant (P<0.01) compared with the initial stage of the flower bud
 
图1 2 Lm PAL1基因在各器官中的相对表达量Fig.12 Relative expression of Lm PAL1 gene in several organs  
图1 2 Lm PAL1基因在各器官中的相对表达量Fig.12 Relative expression of Lm PAL1 gene in several organs   下载原图
 
 
*表示与叶比较差异性显著 (P<0.05) ;**表示与叶比较差异性极显著 (P<0.01) *indicates that the difference is significant (P<0.05) ;**indicates that the difference is very significant (P<0.01) compared with leaf
 
 
PAL是苯丙烷代谢途径的第一个关键酶, 催化苯丙氨酸脱氨生成反式肉桂酸, 是连接初生代谢和次生代谢的关键酶[16]。PAL基因是一个比较保守的基因, 该基因在不同植物种编码区变化范围不大, PAL基因编码区一般在2 100 bp左右, 但存在一些差异[5]。在众多PAL基因研究中, 发现其主要在植物生长发育和抗逆防御中发挥着重要作用, 如抗病防御反应、抗虫反应、响应机械损伤、响应重金属胁迫等[11], 同时PAL基因与绿原酸含量的积累密切相关[12]。灰毡毛忍冬的花作为山银花入药, 文献研究表明灰毡毛忍冬的不同花期花中绿原酸含量有差异[17], 为探究不同花期花的绿原酸含量与LmPAL1表达量相关性, 本研究运用了qRT-PCR对不同花期花进行表达模式分析, 发现LmPAL1在灰毡毛忍冬不同花期表达量存在差异;文献研究表明灰毡毛忍冬的不同器官绿原酸含量有差异[18], 本研究对比了LmPAL1在不同器官中相对表达量, 结果为花>茎>叶, 说明该基因在同一植物不同部位基因的表达量具有组织特异性。Yuan[4]等实验表明PAL1在灰毡毛忍冬和忍冬中, 花的相对表达量高于叶, 与本研究结果相一致。目前已有研究者将基因转入模式植物中, 进行功能验证, Howles等[19]将PAL基因转入烟草, 比较转基因植株与野生型植株发现, PAL转录水平提高, 其转录产物苯丙氨酸解氨酶的含量比野生型植株高数倍, 转基因植株中叶片绿原酸含量也显著增加。Chang等[20]从拟南芥中克隆出与绿原酸生物合成相关酶基因AtPAL2, 将该基因构建过表达载体转化至烟草, 在烟草中过表达AtPAL2导致转基因植物绿原酸含量比野生型高2倍。以上研究说明PAL基因在绿原酸生物合成途径中可能具有促进绿原酸合成的功能, 后期本项目组也将进一步进行LmPAL1基因功能验证。
 
 
《中国药典》2005年版始将金银花和山银花分2个药材收载, 在此之前南方地区习将山银花项下灰毡毛忍冬当做金银花使用, 两者的药材性状特征比较相似。本研究通过同源性比对发现灰毡毛忍冬与同科同属的忍冬PAL1氨基酸相似度达99%, 且系统进化树分析两者归为一个小支, 两者具有较高的亲缘关系。笔者对比两者PAL1碱基序列, 发现忍冬PAL1的ORF碱基不确定, 其氨基酸也有不确定, 而本研究成功克隆了具有完整ORF的Lm PAL1基因c DNA全长。同时有研究表明, 灰毡毛忍冬绿原酸含量是忍冬的2倍左右[21], 该现象可能与PAL1氨基酸序列差异, 引起该基因在2种植物体表达不同相关。
 
 
灰毡毛忍冬是我国南方山银花的主栽培品种, 主要分布在在湖南、重庆等地[22], 近年来被广泛应用于食品、饮料、保健品、化妆品和兽医用等方面。目前灰毡毛忍冬研究主要集中在化学成分和药理作用方面, 分子生物学研究较少, 本研究成功克隆LmPAL1基因全长, 为进一步研究该基因的功能以及遗传改良灰毡毛忍冬品质奠定基础, 同时对完善灰毡毛忍冬绿原酸生物合成和调节机制具有重要意义。且灰毡毛忍冬是否能作为金银花入药还有很大的争议, 忍冬为金银花的原植物, 灰毡毛忍冬为山银花的原植物之一, 鉴别两者的方法主要是基原、性状、显微、理化鉴别等, 而分子生物学具有快速、准确、现场化的特点[23], 可以通过分子生物学鉴别两者, 同时本研究也为从分子水平探究两者绿原酸含量差异提供理论依据, 具有一定的研究意义。
 

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文章名称:灰毡毛忍冬LmPAL1基因的克隆及表达分析

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