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头花蓼提取物中具抗淋球菌作用的有效部位研究

分类:(二) 发表时间:2019-08-20

头花蓼为蓼科植物头花蓼Polygonum capitatum Buch.-Ham.ex D.Don Prodr的干燥全草或地上部分, 具有清热利湿、解毒止痛、活血散瘀以及利尿通淋之功效, 主治泌尿系统感染、血尿、湿疹、肾盂肾炎
头花蓼为蓼科植物头花蓼Polygonum capitatum Buch.-Ham.ex D.Don Prodr的干燥全草或地上部分, 具有清热利湿、解毒止痛、活血散瘀以及利尿通淋之功效, 主治泌尿系统感染、血尿、湿疹、肾盂肾炎等症[1], 收载于《贵州省中药材、民族药材质量标准》2003年版, 是贵州常用苗药。长期临床应用表明, 头花蓼在治疗泌尿系统感染方面具有显著疗效。近年来对头花蓼的研究多为化学成分[2,3,4]、不同采收期[5,6]、药材品质[7,8]等方面, 据报道头花蓼提取物可用于抗菌[9]、抗炎[10,11,12]、镇痛[13]、利尿、治疗泌尿系统结石、治疗肾盂肾炎以及前列腺炎[14]。淋球菌 (淋病奈瑟菌) 属于人体病原菌, 只感染人类, 常因非正常接触 (主要是性接触) 而引起泌尿生殖系统化脓性感染。尽管目前有诸多关于制备头花蓼提取物的报道, 然而在抗淋球菌作用方面研究较少。该研究通过头花蓼不同部位提取物对淋球菌的抗菌实验, 为临床治疗淋球菌感染的泌尿生殖系统化脓性感染提供依据和指导。
 
本研究通过对头花蓼提取物用水及10%~100%甲醇进行梯度洗脱, 采用药敏纸片法[15]对其有效部位进行抗淋球菌实验, 并采用超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间高分辨质谱法 (UPLC-Q-TOF-MS) 对头花蓼具有抗淋球菌作用的有效部位进行分析鉴定, 以探索头花蓼抑菌作用的药效物质基础, 并为开发临床有效产品提供参考。
 
1 材料
1.1 仪器
超高效液相色谱-飞行时间质谱联用仪[美国Waters公司Acquity超高效液相色谱系统、高压二元梯度泵、恒温自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、电喷雾接口、四极杆飞行时间质谱仪 (Q-TOF-MS, Bruker公司) 、Hystar工作站;美国Agilent公司1290 Infinity液相色谱系统、6550iFunnel四极杆飞行时间质谱仪﹑MassHunter工作站];大孔树脂MCI (日本三菱公司生产的MCIGEL系列) ;TGL-16G离心机 (上海安亭科学仪器厂) ;100 Hz超声处理器 (北京创新德超电子研究所) 。
 
1.2 药材与试剂
头花蓼药材由贵州威门药业股份有限公司贵州施秉头花蓼GAP种植基地提供, 由贵阳中医学院魏升华教授鉴定为蓼科植物头花蓼Polygonum capitatum Buch.-Ham.ex D.Don Prodr的干燥全草;甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯 (ACS公司) ;MilliQ水由Millipak-20 Filter Unit处理;其他试剂均为分析纯;药敏纸片 (北京天坛生物制品所) ;四环素片 (Tet, 批号150504, 广东华南药业集团有限公司) ;医用生理盐水和巧克力平板均为自制。
 
1.3 菌株
淋球菌株Neisseria gonorrhoeae由广东省皮肤性病防治中心性病实验室提供。
 
2 方法
2.1 头花蓼提取物及有效部位的制备
2.1.1 头花蓼提取物的制备
将头花蓼地上部分鲜品或干品加5~15倍量的50%~90%乙醇回流提取1~3次, 滤过, 滤液浓缩、干燥, 得醇浸膏, 取醇浸膏混悬于甲醇中, 超声处理0.5~5 h, 离心, 将上清液加载到MCI大孔树脂柱上;分别用水及10%~100%甲醇依次进行梯度洗脱, 收集各部分洗脱液, 回收溶剂, 由不同溶剂洗脱获得的部位干燥, 得到的甲醇洗脱物混合物, 即为头花蓼提取物。
 
2.1.2 头花蓼有效部位的制备
“2.1.1”项下头花蓼提取物用水及10%~100%甲醇依次进行梯度洗脱所收集各部分洗脱液, 经回收溶剂处理后得到的不同溶剂洗脱获得的部位, 干燥。其中10%~20%甲醇洗脱物为部位F1;30%甲醇洗脱物为部位F2;35%甲醇洗脱物为部位F3;40%甲醇洗脱物为部位F4;45%甲醇洗脱物为部位F5;50%甲醇洗脱物为部位F6;55%甲醇洗脱物为部位F7;60%~75%甲醇洗脱物为部位F8;80%~100%甲醇洗脱物为部位F9。其中F1~F5用去离子水 (DW) 溶解, F6~F9用50%乙醇溶解, 质量浓度均为40 mg/mL。
 
2.2 抗淋球菌实验
淋球菌用生理盐水配成0.5麦氏浊度 (A625值在0.08~0.10) 的菌悬液, 无菌棉签浸取菌悬液均匀涂布巧克力平板, 用无菌镊子将直径约6 mm的药敏纸片贴于平板表面, 每个纸片上分别加入F1~F9各样品、DW、50%乙醇、Tet (10 mg/mL) 。第1次抑菌实验点样量分为10、3、1μL。第2次与第3次抑菌实验只重复点样量10、3μL, 然后平皿置37℃, 5%~10%二氧化碳培养箱中孵育18~24 h, 量取抑菌环直径[15], 3次实验结果求平均值。
 
2.3 头花蓼抗淋球菌有效部位UPLC-TOF-MS分析
2.3.1供试液配制
称取适量“2.1.2”项下制备的头花蓼F3部位粉末, 加入70%甲醇制成5 mg/mL的混悬液, 超声溶解, 混悬液稀释10倍, 滤过, 即得。
 
2.3.2色谱条件
色谱柱为Acquity BEH C18柱 (100 mm×2.1 mm, 1.7μm) , 以0.1%甲酸水溶液为流动相A, 0.1%甲酸乙腈溶液为流动相B, 梯度洗脱:0~0.5 min, 5%B;0.5~20 min, 5%~18.5%B;20~28 min, 18.5~100%B;28~30 min, 100%B;30~30.1 min, 100%~5%B;30.1~32 min, 5%B;柱温40℃;体积流量0.35 mL/min;进样量2μL。
 
2.3.3质谱条件
利用Bruker Q-TOF采集一级质谱数据, ESI离子源, 离子源温度180℃, 毛细管电压4 500 eV;负离子检测模式;喷雾压力250 kPa (2.5 bar) ;干燥氮气体积流量8.0 L/min;扫描范围m/z 100~2 000。利用Agilent Q-TOF采集二级质谱数据, ESI离子源, 离子源温度250℃, 干燥氮气体积流量13 L/min, 鞘气 (氮气) 温度300℃, 鞘气体积流量11 L/min;负离子检测模式;扫描范围m/z 100~2 000, 碰撞能量10~40 eV。
 
2.3.4 有效部位的成分确认
通过检索数据库Dictionary of Natural Products中头花蓼的化学成分以及关于头花蓼化学成分研究的相关报道[16,17,18], 再根据一级质谱所提供的精确相对分子质量﹑同位素丰度和同位素间距等信息与数据库中的化学成分进行匹配, 并进一步利用二级质谱数据, 根据所得的碎片信息来对各色谱峰进行鉴定。
 
3 结果
3.1 抗淋球菌实验结果
3.1.1 第1次实验结果
如图1所示, 部位F3的抑菌圈直径明显大于其他样品或空白溶剂 (DW或50%乙醇溶液) 的抑菌圈直径。第2次抑菌实验结果见图2。
 
 图1 第1次抑菌实验结果Fig.1 Results of first bacteriostatic experiment
图1 第1次抑菌实验结果Fig.1 Results of first bacteriostatic experiment   下载原图
 
 图2 第2次抑菌实验结果Fig.2 Results of second bacteriostatic experiment
图2 第2次抑菌实验结果Fig.2 Results of second bacteriostatic experiment   下载原图
 
3.1.2 抑菌圈直径结果
抑菌圈直径6 mm即为与纸片直径相同, 无抑菌作用;抑菌圈直径越大, 抑菌作用越强。在加样量为10μL时, F3 (400μg) 有良好的抑菌作用, F2、F4~F6有微弱的抑菌作用, 而其他部位无抑菌作用。在上样量3μL时, F3 (120μg) 有一定的抑菌作用, 其他部位无抑菌作用。见表1。
 
3.2 头花蓼抗淋球菌有效部位UPLC-TOF-MS分析结果
结果显示在保留时间约3.9 min处和保留时间约5.3 min处显示可水解鞣质 (三没食子酰葡萄糖) 的色谱峰, 见图3和表2。
 
4 讨论
头花蓼醇提取物经大孔树脂洗脱所获得的洗脱物中, 35%甲醇洗脱物 (部位F3) 具有与四环素相当的抑菌效果。该有效部位具有良好抗淋球菌作用, 其他各部位的抑菌效果弱。甚至抑菌 (淋球菌) 作用阴性, 例如部位F1、F7、F8、F9。通过进一步的UPLC-TOF-MS分析, 可知该部位有效成分主要为可水解鞣质 (三没食子酰葡萄糖) , 可水解鞣质 (三没食子酰葡萄糖) 是头花蓼中抗淋球菌作用的主要活性物质。
 
据报道, 淋球菌的唯一宿主是人类。因为社会的因素, 淋病在人与人之间近年来的传播与流行呈上升趋势, 导致很难控制, 若治疗不够彻底, 就会扩散到人的生殖系统。胎儿也会经患该病母亲的产道感染进而造成新生儿的淋病性急性结膜炎。人类相对淋球菌是没有自然免疫力的, 比较容易感染, 染病后免疫力较弱, 很容易再感染[19]。本研究通过对头花蓼醇提物不同洗脱部位进行体外抗菌活性研究, 筛选出头花蓼提取物中35%甲醇洗脱物 (部位F 3) 在抗淋球菌方面具有良好的效果, 并通过UPLC-TOF-MS进行分析, 可水解鞣质 (三没食子酰葡萄糖) 是头花蓼中抗淋球菌作用的主要活性物质。头花蓼抑菌作用已有大量报道[20,21], 然而头花蓼药材提取物中其他洗脱分离部位的生物活性及其抑菌机制有待深入研究。后续将进行该有效部位的抑菌机制研究, 为头花蓼药材更好地应用于临床治疗淋病提供研究基础。

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文章名称:头花蓼提取物中具抗淋球菌作用的有效部位研究

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