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基于UPLC-Q/TOF-MS的丹参-川芎对局灶性脑缺血大鼠保护作用的脂质组学研究

分类:(二) 发表时间:2019-08-20

缺血性脑卒中具有高发病率、高死亡率、高致残率、高复发率的特点, 严重威胁老年人身体健康和生活质量。脑缺血损伤是多机制、多信号通路网络共同参与的极为复杂的病理过程, 脑缺
缺血性脑卒中具有高发病率、高死亡率、高致残率、高复发率的特点, 严重威胁老年人身体健康和生活质量。脑缺血损伤是多机制、多信号通路网络共同参与的极为复杂的病理过程, 脑缺血后一系列级联生化反应 (如谷氨酸兴奋性毒性、钙离子内流、炎症反应、脑水肿、血脑屏障的损坏、细胞坏死) 所引起的神经损伤[1]构成了脑缺血损伤的内在基础。
 
近年来发现脂质参与了脑缺血损伤/保护的诸多病理环节, 其在脑缺血损伤进程中具有特殊地位。缺血性脑卒中患者往往存在胆固醇升高及磷脂酰胆碱 (PC) 、磷脂酰乙醇胺 (PE) 降低等脂质代谢紊乱症状[2]。脑缺血后磷脂酶A2激活导致溶血磷脂增加[3], 脑实质活性氧增加同样会提升溶血磷脂水平, 其可加重炎症反应[4]。整体、动态、全面评价脑缺血损伤对其预后评价、药物疗效评估具有重要意义。脂质组学是对脂质进行系统分析, 比较不同生理状态下脂代谢网络的变化, 进而识别代谢调控中关键脂质生物标志物的新兴学科[5], 有助于从整体评价药物的作用特性。
 
中医药在防治缺血性脑卒中方面积累了丰富的治疗经验, 丹参-川芎是用于缺血性脑卒中治疗的常用药对[6,7,8,9], 目前对其研究常在脑缺血/再灌注的整体动物、离体器官药效学层面上[10], 尚无代谢组学或脂质组学的相关报道。本研究基于脂质在脑缺血损伤中发挥的重要作用, 采用超高效液相色谱四级杆飞行时间质谱 (UPLC-Q/TOF-MS) 检测经丹参-川芎药对按《中国药典》常用量干预的局灶性脑缺血模型大鼠的血浆脂质代谢物的变化, 采用正交偏最小二乘判别分析 (OPLS-DA) 法寻找潜在的脂质生物标志物, 并由此探索丹参-川芎药对脑缺血损伤保护作用的机制, 为新药研发及临床应用提供参考。
 
1 材料
1.1 仪器
UPLC-Q/TOF-MS:日本岛津LC-30AD超高效液相, 含SIL-30AC自动进样器, CTO-20AC柱温箱;美国AB/SCEIX公司AB SCEIX TripleTM TOF 5600+飞行时间质谱, 含Analyst TF 1.7、Peak View Software、Marker View工作站。LGJ-12真空冷冻干燥机 (北京松源华兴科技发展有限公司) ;TDX-1涡旋混合器 (北京方通达科技有限公司) ;E3116R台式高速低温离心机 (美国Essenscien公司) ;24孔氮吹仪 (青岛海科科技有限公司) ;V8涡旋混合器 (美国Essenscien公司) ;Finnpipette F2移液枪 (Thermo Scientific公司) ;MDFC8V-80℃超低温冰箱 (日本Panasonic公司) 。
 
1.2 试药与试剂
丹参药材 (广州至信药业有限公司, 批号190901) 、川芎药材 (广州至信药业有限公司, 批号161201) , 均由广州中医药大学张英丰副教授鉴定, 分别为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎和伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎;2, 6-二叔丁基-4-甲基酚 (BHT, 美国Sigama公司) ;乙腈 (色谱纯, 批号QAFA1H, 霍尼韦尔公司) ;TTC染色试剂 (Sigma公司, 批号T8877) ;实验用超纯水通过MILLI-Q系统获得。
 
1.3 动物
清洁级雄性SD大鼠, 体质量300~350 g, 广州中医药大学动物实验中心提供, 生产许可证号SCXK (粤) 2013-0020。
 
2 方法
2.1 丹参-川芎水煎液冻干物的制备
根据《中国药典》用量, 以丹参-川芎 (15∶10) 的比例, 取药材于500 mL烧杯中, 去离子水浸泡15min, 加水煎煮2次, 加水量分别为4、3倍, 时间依次为30、20 min, 煎好后滤过并压榨药渣。将水煎液和压榨液合并, 静置、离心, 吸取上清液于冷冻干燥机托盘中, -80℃预冻12 h, -80℃、1 Pa条件下真空冷冻干燥36 h, 冻干物 (经HPLC及UPLC测定, 冻干物中含丹酚酸B 31.1 mg/g、阿魏酸1.2 mg/g) 真空干燥器保存备用。临用前加生理盐水溶解。
 
2.2 大鼠局灶性脑缺血模型的复制与评价
2.2.1 模型制备[11]
取SD大鼠, 麻醉后仰位固定, 钝性分离左侧颈总动脉 (CCA) 、颈外动脉 (ECA) 和颈内动脉 (ICA) , 分别在CCA近心端、ICA和ECA根部近分叉处挂线备用, 结扎CCA近心端以及ECA, 在距CCA分叉部4 mm处剪一“V”形切口, 将栓线 (取直径0.26 mm尼龙鱼线50 mm, 一端酒精灯加热使之成光滑球面, 将其垂直浸入在熔化的石蜡中并迅速提起, 立即凝固的石蜡可牢固地黏附在鱼线表面, 使其头端圆滑。在距球面20、30mm的位置做标记, 浸泡0.1%的多聚赖氨酸溶液中, 取出自然风干) 插入到ICA, 用眼科镊轻推栓线送入颅内, 从血管分叉处开始算, 插入深度在17 mm时稍有阻力感时立即停止, 结扎ICA以固定线栓, 缝合皮肤。实验结束后将大鼠断头处死, 迅速冰上取出脑组织。
 
2.2.2 神经行为学评分
采用5级4分评分法。0分:无神经功能缺损症状;1分:轻度神经功能缺损, 提尾时不能完全伸展对侧前肢;2分:中度神经功能缺损, 出现追尾征;3分:重度神经功能缺损, 行走困难, 向对侧倾倒;4分:不能自发行走, 意识水平下降。
 
2.2.3 TTC染色
大鼠脑组织快速冷冻约20 min, 去除小脑、脑干。冠状切片均匀切成2 mm厚度的脑组织5~6片, 迅速置于1%TTC磷酸盐缓冲液中, 37℃恒温避光孵育15~30 min, 不时翻动脑片使其染色均匀, 待完全显色后置4%多聚甲醛溶液中固定保存。
 
2.2.4 舍弃标准
无明显神经功能缺损表现或症状很轻, 评分低于1分者;蛛网膜下腔出血、大脑中动脉起始部或其附近的大脑动脉环动脉有凝血块者;未存活到规定时间点死亡者;TTC染色未见梗死灶者。
 
2.3 分组与给药
雄性SD大鼠随机分为对照组8只、假手术组8只、丹参-川芎干预组9只、模型组8只。假手术组麻醉后分离右颈总动脉结扎, 不植入线栓, 缝合伤口。模型组按照上述方法造模并进行神经行为学评分, 按照入选和舍弃标准确定最终样本量。对照组、模型组、假手术组每天ig给予生理盐水, 丹参-川芎干预组造模后, 第2天按照体表面积折算给予相应体积的冻干物 (总生药剂量为2.916 g/kg, 丹参生药剂量1.944 g/kg, 川芎生药剂量0.972 g/kg) 生理盐水溶液, 连续7 d。末次给药1 h后各组大鼠眼内眦采抗凝血1 m L, 4℃、4 000 r/min离心10min分离血浆, -80℃保存备用。
 
2.4 丹参-川芎干预大鼠局灶性脑缺血的脂质组学研究
2.4.1 液质联用条件
(1) UPLC色谱条件:Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱 (100 mm×2.1mm, 1.8μm, 含保护柱) , 柱温30℃, 样品室温度4℃, 流动相为0.1%甲酸水溶液 (A) -乙腈 (B) , 梯度条件:0~3 min, 90%~40%A;3~6 min, 40%~20%A;6~9 min, 20%~10%A;9~10 min, 90%~100%B;10~13 min, 100%B;13~14 min, 100%~10%B;14~15 min, 10%B;体积流量0.3m L/min。 (2) 质谱条件:在全扫描获得一级谱图的同时进行数据相关采集模式 (IDA) 获得二级谱图。正离子模式:一级质谱m/z扫描范围为100~2 000, 质量偏差为m/z 0.050, 碰撞能 (CE) 为45 eV。二级质谱采用high sensitivity模式, m/z扫描范围为50~2 000, 碰撞能为45 eV。离子源雾化气 (GS1) 和辅助气 (GS2) 均为55 Pa, 气帘气 (curtain gas, CG) 为35 Pa。温度为500℃, 喷雾电压为5 500 V, 去簇电压 (DP) 为80 V。负离子模式:一级质谱m/z扫描范围为100~2 000, 质量偏差为m/z 0.050, 碰撞能为45 eV, 二级质谱m/z扫描范围为50~2 000, 碰撞能为45 eV。GS1和GS2均为55 Pa, CG为35 Pa。温度为500℃, 喷雾电压为-4 500 V, DP为-100 V。
 
2.4.2 血浆样品前处理及测定
血浆自然解冻后精密吸取0.15 mL血浆于1.5 mL离心管内 (冰上操作) , 加入0.45 mL 4℃氯仿-色谱甲醇混合液 (2∶1, 含0.01%BHT) 涡旋60 s, 室温下静置5 min, 加入115μL超纯水混匀, 12 000 r/min离心10 min, 体系分为上层水相、中间层蛋白沉淀物、下层有机相。吸取下层液200μL至5 m L刻度离心管内, 40℃氮气吹干, 加300μL乙腈涡旋1 min, 转移至1.5 mL离心管内, -20℃冷冻后13 000 r/min离心10 min, 2次, 吸取上清液200μL于装有内衬管的样品瓶中进样。正、负离子模式各进样4μL, 获得总离子流图 (TIC) 。
 
取各组血浆样品等体积混合, 前处理后作为质控样品。正式进样前连续进样6次使系统预适应和平衡。分析过程按照“对照组-模型组-假手术组-丹参-川芎干预组”的顺序交叉进样, 每进8份样品进样1次质控样品, 用于评价整个实验过程中系统稳定性。
 
2.4.3 脂质组学数据处理
采用PeakView Software软件进行峰校准、背景扣除、面积归一化和数据简化处理, MarkerView软件生成正、负离子模式下的样品名-质荷比与保留时间数据对-离子强度的三维矩阵, 经过滤噪处理后, 导入SIMCA-P 14.1软件 (瑞典Umetrics公司) , 进行标准化前处理, 采用Hotelling’s T2及DMod X模型筛选异常样本。
 
采用Pareto标度法 (Par) 对对照组和模型组进行OPLS-DA处理, 建立脂质组学模型, 以R2 (cum, 表示所解释的模型差异) 、Q2 (cum, 表示所预测的模型差异) 作为脂质组学模型优劣的标准, 自动拟合提取主成分。通过S型图 (S-plot) 、VIP图, 识别局灶性脑缺血模型血浆脂质生物标志物。通过七重循环交叉验证 (cross validation, CV) 及300次迭代置换检验以评价及确认模型的质量。
 
在进行准分子离子峰的归纳后, 通过脂质组学数据分析, 以变量重要性投影值 (variable importance in the projection, VIP) >1、Jack-knife不确定区间不跨越零点、S-plot中∣Pcorr∣>0.58为脂质生物标志物的入选标准。同时采用SPSS 19软件 (美国IBM公司) 进行模型组与对照组、丹参-川芎干预组与模型组潜在脂质生物标志物Student’s t-test等单维统计分析, 以P<0.05视为具有显著性, 并计算变异倍数 (FC) 。
 
脂质标志物结构鉴定采用精确质量数匹配 (误差<1×10-5) 和二级质谱解析的方式, 检索互联网专业数据库, 如HMDB (http://www.hmdb.ca/) 、METLIN (http://metlin.scripps.edu/) 、Lipidmaps (http://www.lipidmaps.org) 等, 同时依据偶氮原则、正负离子交互验证模式等信息鉴定脂质。在此基础上, 对4组脂质组学数据进行OPLS-DA分析, 结合得分图 (scores plot) 及层次聚类分析 (HCA) 图, 整体评价丹参-川芎水煎液冻干物对局灶性脑缺血损伤大鼠模型的干预作用, 分析其对脂质生物标志物的影响。通过七重循环交叉验证及300次迭代置换验证实验评价模型的质量。
 
3 结果
3.1 大鼠局灶性脑缺血模型评价
3.1.1 神经行为学评分结果
大鼠局灶性脑缺血模型术后出现明显的神经行为学症状, 如肌张力降低、跑动动作明显减少、出现追尾征等, 评分在1~2分。根据前期造模经验, 评分在2分以上者, 常常会于术后急性期死亡, 故严格控制手术操作流程及线栓插入深度对大鼠存活率至关重要。
 
3.1.2 TTC染色结果
脑组织染色结果表明, 正常大鼠脑组织染为均匀的深红色, 未见苍白色的梗死区。模型组大脑缺血侧半球大部分脑组织为脑梗死区, 不染色, 呈现明显的苍白色。见图1。
 
 图1 大鼠脑TTC染色结果Fig.1 TTC staining figure of rat brain
图1 大鼠脑TTC染色结果Fig.1 TTC staining figure of rat brain   下载原图
 
3.2 大鼠血浆UPLC-Q/TOF-MS TIC的特征差异
UPLC-Q/TOF-MS TIC见图2和3。代谢产物得到了良好分离, 且组间存在差异。负离子模式下所得到的信息量多于正离子模式, 色谱峰及潜在标志物个数多于正离子模式, 正、负离子模式TIC图存在显著差异, 正、负离子模式下模型组与假手术组主要峰强度较为接近, 而对照组与丹参-川芎干预组主要峰强度接近。
 
3.3 大鼠血浆脂质组学研究的异常样本筛选
以样本序号为横坐标, 绘制Hotelling’s T2及DModX图。Hotelling’s T2图纵坐标反映了每个样本与模型得分空间的距离, 以超越95%临界值[T2Crit (95%) ]为可疑, 以超越99%临界值[T2Crit (99%) ]为高度可疑。DModX图以超过临界值[DCrit (0.05) ]2倍可判定为异常值。结果表明, 负离子模式下各组不存在异常样本, 正离子模式下假手术组样本6 Hotelling’s T2值超越临界值, 高度异常, 予以剔除, 各组剩余样本参与建立模型。结果见图4和5。
 
 图2 各组大鼠血浆UPLC-Q/TOF-MS正离子模式TIC图Fig.2 UPLC-Q/TOF-MS TIC plot of rats plasma under positive ion pattern
图2 各组大鼠血浆UPLC-Q/TOF-MS正离子模式TIC图Fig.2 UPLC-Q/TOF-MS TIC plot of rats plasma under positive ion pattern   下载原图
 
 图3 各组大鼠血浆UPLC-Q/TOF MS负离子模式TIC图Fig.3 UPLC-Q/TOF-MS TIC plot of rats plasma under negative ion pattern
图3 各组大鼠血浆UPLC-Q/TOF MS负离子模式TIC图Fig.3 UPLC-Q/TOF-MS TIC plot of rats plasma under negative ion pattern   下载原图
 
 图4 Hotelling’s T2图Fig.4 Hotelling’s T2 plot
图4 Hotelling’s T2图Fig.4 Hotelling’s T2 plot   下载原图
 
 图5 DMod X图Fig.5 DModX plot
图5 DMod X图Fig.5 DModX plot   下载原图
 
3.4 大鼠脑缺血模型脂质生物标志物识别及鉴定
正、负离子模式下模型组与对照组样本脂质组学数据进行OPLS-DA处理, 成功建立了脂质组学模型, R2 (cum) >0.5、Q2 (cum) >0.5, 充分提取了组间的差异信息, 具有良好的预测能力。正、负离子模式七重循环交叉验证单因素方差分析 (CV-ANOVA) 均P<0.05, 据此判别模型筛选的组间差异代谢标志物可充分反映局灶性脑缺血模型大鼠与正常大鼠的差异特征。得分图见图6。模型组和对照组分别位于得分空间的左、右两部分, 表明其血浆脂质组学特征存在极其显著差异。VIP图和S形图见图7、8。S形图中标志物分布的区域差异反映了模型组标志物相较于对照组升高或降低。
 
 图6 对照组与模型组脂质组学得分图Fig.6 Lipidomics scores plot between control and model groups
图6 对照组与模型组脂质组学得分图Fig.6 Lipidomics scores plot between control and model groups   下载原图
 
 图7 对照组与模型组脂质组学VIP图Fig.7 Lipidomics VIP plot between control and model groups
图7 对照组与模型组脂质组学VIP图Fig.7 Lipidomics VIP plot between control and model groups   下载原图
 
 图8 对照组与模型组脂质组学S形图Fig.8 Lipidomics S plot between control and model groups
图8 对照组与模型组脂质组学S形图Fig.8 Lipidomics S plot between control and model groups   下载原图
 
正离子模式300次置换验证结果R2>Q2, R2截距为0.753, Q2截距为-0.663, 负离子模式300次置换验证实验结果R2>Q2, R2截距为0.549, Q2截距为-0.512。Q2均在R2之下, 且Q2的回归直线与y轴的交点在负半轴, 说明该模型未过度拟合。结果见图9。
 
脂质生物标志物分别为PS (21:0/0:0) 、PG (12:0/17:0) 、C16 sphinganine、phytosphingosine、PE[18:1 (9Z) /0:0]、PC (16:1/2:0) 、PC (0:0/18:0) 、PC (16:1/0:0) 、PC (16:0/0:0) 、PC (18:2/0:0) 、PC (18:1/0:0) 、PC (18:0/0:0) 、PC (20:5/0:0) 。结果见表1。
 
正离子模式下, m/z 606.317 7为加合离子[M+K]+, 二级质谱具有280.117 2、223.050 5等主要二级碎片离子, 鉴定为PS (21:0/0:0) ;m/z 698.495 0为加合离子[M+NH4]+, 二级质谱具有681.471 8、119.085 8等主要二级碎片离子, 鉴定为PG (12:0/17:0) ;m/z 274.274 6为准分子离子[M+H]+, 具有274.273 6、256.263 1、106.086 9等主要二级碎片离子, 鉴定为C16 sphinganine;m/z 318.300 4为准分子离子[M+H]+, 具有318.299 3、300.288 9、256.262 3、102.092 0等主要二级碎片离子, 鉴定为phytosphingosine;m/z 497.338 6为加合离子[M+NH4]+, 具有497.343 7、184.073 5、104.107 6等主要二级碎片离子, 鉴定为PE[18:1 (9Z) /0:0];m/z518.320 6为加合离子[M+H-H2O]+, 具有459.248 5、313.273 0、104.107 7等主要二级碎片离子, 鉴定为PC (16:1/2:0) ;m/z 524.369 5为准分子离子[M+H]+, 具有524.372 2、184.073 2、104.107 9等主要二级碎片离子, 鉴定为PC (0:0/18:0) 。
 
 图9 300次迭代置换检验图Fig.9 Three hundred times iterations permutations test plot
图9 300次迭代置换检验图Fig.9 Three hundred times iterations permutations test plot   下载原图
 
表1 基于UPLC-Q/TOF-MS鉴定的差异脂质代谢物Table 1 Differential metabolites identified by UPLC-Q/TOF-MS     下载原表
 
 表1 基于UPLC-Q/TOF-MS鉴定的差异脂质代谢物Table 1 Differential metabolites identified by UPLC-Q/TOF-MS
*模型组vs对照组, 变化倍数是仪器测得的模型组和对照组脂质成分平均相对强度的比值, ↑和↓分别代表该脂质物在模型组中升高和降低;**丹参-川芎干预组vs模型组, 变化倍数是仪器测得的丹参川芎干预组和模型组脂质成分平均相对强度的比值, ↑**和↓**分别代表该脂质物在丹参-川芎干预组中升高和降低*Model group vs control group, fold change is ratio of average relative intensity of lipid components in model group vs control group measured by instrument, The↑and↓represents increase and decrease of lipid in model group, respectively;**Danshen and Chuanxiong group vs model group, fold change is ratio of the average relative intensity of lipid components in Danshen and Chuanxiong group vs model group measured by instrument, The↑**and↓**represents increase and decrease of lipid after Danshen and Chuanxiong intervention group, respectively
 
负离子模式下, m/z 538.315 9为准分子离子[M+HCOO]-, 具有478.295 7、253.217 1、224.067 8等主要二级碎片离子, 鉴定为PC (16:1/0:0) 。m/z540.331 7为准分子离子[M+HCOO]-, 具有480.311 4、255.233 2、224.069 5等主要二级碎片离子, 鉴定为PC (16:0/0:0) 。m/z 568.362 3为准分子离子[M+HCOO]-, 具有508.340 8、283.264 2、224.069 2等主要二级碎片离子, 鉴定为PC (18:0/0:0) 。m/z 586.318 0为准分子离子[M+HCOO]-, 具有526.297 5、301.216 7、224.068 4等主要二级碎片离子, 鉴定为PC (20:5/0:0) 。
 
正离子模式m/z 520.340 0为准分子离子[M+H]+, 具有520.340 9、184.073 0、104.107 2等主要二级碎片离子, 鉴定为PC (18:2/0:0) ;负离子模式下m/z 564.331 7为加合离子[M+HCOO]-, 具有504.311 2、279.232 9、224.069 1主要二级碎片离子, 同样鉴定为PC (18:2/0:0) , 正、负离子模式具有相同的保留时间。
 
正离子模式m/z 522.355 1为准分子离子[M+H]+, 具有522.354 7、184.072 9、104.108 0等主要二级碎片离子, 鉴定为PC (18:1/0:0) ;负离子模式下m/z 566.346 5为加合离子[M+HCOO]-, 具有506.326 9、281.248 6、224.069 1主要二级碎片离子, 同样鉴定为PC (18:1/0:0) , 正、负离子模式具有相同的保留时间。
 
3.5 丹参-川芎水煎液冻干物可有效调节脑缺血大鼠血浆脂质代谢
正、负离子模式下各组脂质组学数据进行OPLS-DA处理, 所建立的脂质组学模型R2 (cum) >0.5、Q2 (cum) >0.5, OPLS-DA模型充分提取了组间的差异信息, 该模型具有良好的预测能力, 模型建立成功。正离子模式300次置换验证实验结果R2>Q2, R2截距为0.774, Q2截距为-0.465, 负离子模式300次置换验证实验结果R2>Q2, R2截距为0.848, Q2截距为-0.328。由于Q2均在R2之下, 且Q2的回归直线与y轴的交点在负半轴, 说明该模型未过度拟合。CV-ANOVA结果表明均P<0.05, 结果表明所建立的脂质组学模型具有较高的可靠性, 预测性能强, 充分提取了组间的差异信息。结果见图10~12。
 
得分图显示正、负离子模式下, 假手术组、模型组、丹参-川芎干预组及对照组样本组内相对集中, 离散度小, 组间良好分离, 丹参-川芎干预组靠拢对照组, 经过药物干预后体内整体脂质代谢特征趋于正常。HCA结果显示总体上可分为假手术组与模型组、丹参-川芎干预组与对照组2大类, 且丹参-川芎干预组距对照组距离最短, 表明经过干预后严重偏离常态的脂质轮廓倾向于恢复常态, 丹参-川芎水煎液冻干物有效逆转了局灶性脑缺血损伤。
 
 图1 0 各组脂质组学数据得分图Fig.10 Lipidomics scores plot
图1 0 各组脂质组学数据得分图Fig.10 Lipidomics scores plot   下载原图
 
4 讨论
本研究采用UPLC-Q/TOF-MS进行了丹参-川芎水煎液冻干物干预局灶性脑缺血大鼠模型的脂质组学研究, 发现并鉴定了部分差异脂质标志物, 整体评价了丹参-川芎的脑缺血损伤保护作用, 丹参-川芎能够使增高或降低的脂质标志物向正常状态回调, 有助于从脂质组学角度阐明丹参-川芎的抗脑缺血损伤的作用机制。
 
本课题结合煎煮法和真空冷冻干燥法处理药材。煎煮法符合数千年来临床传统用药习惯, 冻干物的固体形态避免了水煎液久贮易霉变、难以长期保存、需要临时制备、成分易水解氧化的缺点, 对同一批药材煎液冻干避免了水煎液重复制备因操作细节和参数的细微变化带来的成分含量和相对比例的波动及差异, 增强了对实验过程和细节的控制, 冻干物良好的水溶性最大程度地还原了水煎液本质, 减小了给药体积, 增强了成分稳定性, 有助于从源头上提高研究结果的质量、可靠性和重现性。
 
 图1 1 脂质组学数据层次聚类分析图Fig.11 Lipidomics hierarchical clustering analysis plot
图1 1 脂质组学数据层次聚类分析图Fig.11 Lipidomics hierarchical clustering analysis plot   下载原图
 
 图1 2 300次迭代置换检验图Fig.12 Three hundred times iterations permutations test plot
图1 2 300次迭代置换检验图Fig.12 Three hundred times iterations permutations test plot   下载原图
 
可靠的建模方法对脂质组学数据解析至关重要。脂质组学是代谢组学的分支学科, 代谢组学建模方法同样适用于脂质组学研究。无监督的方法, 如主成分分析 (PCA) 、聚类分析, 有监督的方法, 如PLS-DA、OPLS-DA等, 在脂质组学研究中各有适用性。本研究中采用了有更高区分能力的OPLS-DA模型。生物标志物的发现是脂质组学研究的难点, 多指标的共同参与有助于判别。VIP的大小反映了该指标 (所对应的离子强度) 对组间差异的贡献能力:VIP越大, 表示该指标与样本分类信息的相关性越高;VIP>1表明该指标表征的组间差异大于组内误差, 可作为代谢标志物的候选指标。S-plot中每一点表示1个代谢物, 离原点距离越远的离散点表示此物质对模型组和对照组大鼠分组的贡献越大, 则成为生物标志物的可能性越大。模型组相对于对照组的离子强度变化倍数 (FC) 及组间t检验P值等单变量分析, 可直观显示两组间代谢物变化的显著性, 从而筛选标志性代谢物。以-lg P对log2FC为坐标系构成的火山图有助于直观发现标志物, 在代谢组学中应用越来越广泛[12,13]。
 
脂质可分为脂肪酸、甘油酯、甘油磷脂等8大类, 机体尤以甘油磷脂含量丰富, 其又可细分为PC、PE、磷脂酰丝氨酸 (PS) 、磷脂酰甘油 (PG) 及磷脂酰肌醇 (PI) 等, 每一大类中由于脂肪酸链的不同又包含有结构相似的诸多磷脂分子。由于脂质性质及含量差异较大, 对其的全面分析是一项具有挑战性的工作。UPLC-Q/TOF-MS结合了色谱分离和质谱检测, 成为脂质组学研究的强有力分析工具。本研究发现, 线栓法复制的大鼠局灶性脑缺血模型大鼠血浆脂质代谢明显异常, 包括多种甘油磷脂和鞘磷脂含量的显著降低。
 
PC与脑缺血联系密切。Lin等[14]研究表明卒中患者与健康成年人血浆PC含量存在显著差异。Rabiei等[15]发现PC含量与局灶性脑缺血大鼠模型脑梗死区体积呈负相关, 说明PC含量在脑缺血中扮演保护性角色。本研究结果表明脑缺血模型大鼠血浆PC含量显著下降, 可作为脑缺血的生物标志物及药物干预的疗效评价指标。Koizumi等[16]研究表明脑缺血区域PC在磷脂酶作用下转化为LPC (16:0) , 具体表现为PC (16:0/18:1) 含量下降, LPC (16:0) 含量上升。
 
鞘脂是具有高度生物活性、调控细胞功能的一类重要脂质, 除作为细胞膜必不可少的组成部分外, 还参与神经元的生长、信号传导、细胞通透性的维持、调节细胞生长、分化、凋亡等多种功能[17,18]。鞘脂在缺血性脑卒中[19,20]等疾病中扮演了重要角色。鞘氨醇是鞘脂的重要组成部分, 促进细胞凋亡、抑制细胞生长, 参与了脑缺血过程。本研究发现C16鞘氨醇和植物鞘氨醇等鞘脂在模型组大鼠血浆中显著下降, 丹参-川芎可使其明显上调, 其脑缺血损伤保护作用可能与此存在密切联系。
 
研究结果表明丹参-川芎水煎液冻干物能够有效地逆转局灶性脑缺血损伤, 对局灶性脑缺血模型大鼠血浆脂质代谢异常有明显的改善作用, 尤其对PC的改善更加显著。因此推测这可能与其对异常的脂质尤其是甘油磷脂代谢的改善有关, 甘油磷脂代谢通路相关酶活性的调节可能是其作用机制, 有关作用机制还需进一步深入研究。

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文章名称:基于UPLC-Q/TOF-MS的丹参-川芎对局灶性脑缺血大鼠保护作用的脂质组学研究

文章地址:www.sjzjkl.com/lunwenjianshang/_er_/2019/0820/1409.html

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