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Box-Behnken设计-响应面法优化木鳖子霜炮制工艺

分类:(二) 发表时间:2019-08-20

木鳖子Momordicae Semen为葫芦科植物木鳖Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng.的干燥成熟种子。本品性凉, 味苦、微甘;有毒;归肝、脾、胃经;具有散结消肿、攻毒疗疮的功效, 主要用于治疗疡肿毒
木鳖子Momordicae Semen为葫芦科植物木鳖Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng.的干燥成熟种子。本品性凉, 味苦、微甘;有毒;归肝、脾、胃经;具有散结消肿、攻毒疗疮的功效, 主要用于治疗疡肿毒、乳痈、瘰疬、痔漏、干癣等病症[1]。现代药理研究表明, 木鳖子具有抗炎、降压、抗肿瘤等药理作用[2,3,4,5,6]。《中国药典》2015年版记载, 木鳖子有小毒, 需炮制成霜以达到用药安全的目的。目前, 木鳖子霜大多采用经验炮制, 缺乏明确的炮制工艺的参数, 质量难以控制, 进而临床用药疗效及安全性无法得到保障。
 
响应面分析法 (response surface methodology, RSM) 作为一种有效的实验设计方法, 可进行多因素多水平实验研究, 并可研究因素间的交互作用, 根据综合指标得到最优化的工艺结果[7,8,9]。RSM由于试验次数少, 试验精度高, 比正交设计试验法更简化, 比均匀设计更全面, 且得到的关系式可以确定在实验范围内的任何实验点的预测值, 因而显示出突出的优势[10,11]。因此, 本实验采用Box-Behnken设计-响应面法 (BBD-RSM) , 通过建立回归模型及绘制响应面图[12,13]来优化木鳖子霜的最佳炮制工艺。旨在为木鳖子霜炮制工艺、质量标准的制订和临床合理用药提供参考和依据。
 
1 仪器与材料
1.1 仪器
Waters Acquity UPLC H-Class超高效液相色谱系统, 配有四元超高压溶剂系统、自动进样恒温样本管理器、柱温箱、PDA检测器和Empower 2色谱工作站, 美国Waters公司;KQ-300DE型数控超声波清洗器, 昆山市超声仪有限公司;DK-S24电热恒温水浴锅, 上海三发科学仪器公司;DFY-500 (摇摆式) 多功能高速中药粉碎机, 温州顶历医疗器械有限公司;ME55型十万分之一分析天平, 梅特勒-托利多上海有限公司;LH-P058数显笔式酸度计, 杭州陆恒生物科技有限公司。
 
1.2 材料
对照品丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯 (批号DST171120-078, 质量分数≥98%) 、β-谷甾醇 (批号DST160926-04, 质量分数≥99%) 、齐墩果酸 (批号R0160076, 质量分数99%) 均购于成都德思特生物技术有限公司;木鳖子药材, 批号1702010701, 产于安徽, 购于亳州市中药饮片厂, 经安徽中医药大学第一附属医院国家中医药管理局中药制剂三级实验室李立华主任中药师鉴定为葫芦科植物木鳖Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng.的干燥成熟种子;色谱纯乙腈, 美国Sigma公司;甲醇、磷酸等试剂均为分析纯, 购自国药集团试剂公司;屈臣氏蒸馏水;安捷伦公司生产的规格为0.22μm微孔滤膜。
 
2 方法与结果
2.1 木鳖子霜的制备
取一定量木鳖子, 去壳取仁, 放置于真空干燥箱内, 于一定温度下加热一定时间 (按照实验设定温度和时间烘制) , 用粉碎机粉碎过40目筛后, 取出用吸油纸包裹放置于压油机内, 压制去油, 换纸重复操作至吸油纸上基本无油迹, 即可。
 
2.2 3种皂苷成分含量测定
2.2.1 色谱条件
Agilent TC-C18 (2) (250 mm×4.6mm, 5μm) 色谱柱;流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液, 梯度洗脱程序为0~3 min, 10%~20%乙腈;3~10 min, 20%~50%乙腈;10~20 min, 50%~100%乙腈;20~34 min, 100%乙腈;34~36 min, 100%~10%乙腈;36~40 min, 10%乙腈;柱温30℃;体积流量0.8 mL/min;检测波长203 nm;进样量为5μL。色谱图见图1。
 
 图1 混合对照品 (A) 与木鳖子霜 (B) HPLC图谱Fig.1 HPLC profile of mixed reference (A) and Momordicae Semen cream (B)
图1 混合对照品 (A) 与木鳖子霜 (B) HPLC图谱Fig.1 HPLC profile of mixed reference (A) and Momordicae Semen cream (B)   下载原图
 
1-丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯2-β-谷甾醇3-齐墩果酸1-3-O-β-D-glucuronic acid methyl ester 2-β-sitosterol 3-oleanolic acid
 
2.2.2 对照品溶液的制备
精密称取丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯、β-谷甾醇、齐墩果酸对照品适量, 分别置于棕色容量瓶中, 用甲醇定容至刻度制成母液。再用移液管分别从丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯、β-谷甾醇、齐墩果酸母液中精密吸取2.5、0.5、0.1 m L对照品溶液共同置于5 mL棕色量瓶中, 用甲醇定容至刻度, 摇匀, 制成的混合对照品溶液中含有丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯310.5μg/mL, β-谷甾醇34.5μg/mL, 齐墩果酸13.2μg/mL。
 
2.2.3 供试品溶液的制备
按照“2.1”项下方法制备木鳖子霜, 精密称取木鳖子霜约0.75 g, 置于索氏提取器中。于提取瓶中加入60%甲醇100 mL, 回流提取4 h后于水浴锅中90℃蒸干。将所得残渣移至10 m L具塞试管中, 另加10 m L水和0.6 m L硫酸, 振荡, 混匀, 塞紧。将试管置于沸水浴中加热2 h, 取出, 冷却, 并滤过得残渣加色谱甲醇9 m L于10 mL量瓶中, 另加1~2滴硫酸, 并使用LH-P058数显笔式酸度计测pH值至2.0, 摇匀, 定容。最后将样品溶液于50℃水浴中加热4 h, 取出放冷, 加甲醇补至刻度, 备用。进样前取少量样品溶液, 离心, 滤过, 取续滤液, 即可。
 
2.2.4 线性关系考察
按“2.2.1”项下色谱条件, 分别取丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯、β-谷甾醇、齐墩果酸混合对照品溶液2、4、6、8、10μL, 注入超高效液相色谱仪。记录其色谱峰, 色谱峰面积设为纵坐标 (Y) , 进样量设为横坐标 (X) , 进行线性拟合, 得出丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯回归方程Y=201 649.25 X-4 227.7, r=0.999 96, 线性范围为0.621~3.105μg;β-谷甾醇回归方程Y=14 629.45 X-658.9, r=0.999 97, 线性范围为69.2~346.0 ng;齐墩果酸回归方程Y=8 324.05 X+2 788.7, r=0.999 98, 线性范围为26.4~132.0 ng, 所得方程均满足P<0.000 1, 说明拟合方程均显示极其显著的线性关系。
 
2.2.5 精密度考察
精密吸取5号供试品溶液5μL, 在“2.2.1”项色谱条件下重复进样6次, 记录丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯、β-谷甾醇、齐墩果酸峰面积积分值, 计算其RSD值分别为1.11%、0.58%、1.13%, 结果表明仪器精密度表现良好。
 
2.2.6 稳定性考察
精密吸取5号供试品溶液5μL, 在“2.2.1”项色谱条件下重复进样6次, 时间间隔为0、4、8、12、16、24 h。记录丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯、β-谷甾醇、齐墩果酸峰面积积分值, 计算其RSD值分别为2.00%、2.18%、1.91%, 结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
 
2.2.7重复性考察
制备6份5号供试品溶液, 分别精密吸取供试品溶液5μL, 在“2.2.1”项色谱条件下进样, 记录丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯、β-谷甾醇、齐墩果酸峰面积积分值, 计算其RSD值分别为0.17%、0.69%、0.64%, 表明该方法重复性表现良好。
 
2.2.8 加样回收率试验
精密称取6份0.75 g左右的5号样品粉末, 适量对照品溶液, 按照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液。精密吸取供试品5μL, 在“2.2.1”项色谱条件下进样, 记录丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯、β-谷甾醇、齐墩果酸峰面积积分值, 计算其平均回收率, 结果分别为100.19%、102.89%、103.03%, RSD分别为1.16%、1.33%、1.32%。
 
2.3 脂肪油的提取和含量测定
精密称取木鳖子霜粉末1.0 g, 置于索氏提取器中, 另于提取瓶内加入90 m L石油醚 (沸程60~90℃) , 连接提取器及冷凝管, 接上水流, 在85℃水浴中进行回流提取6 h。收集提取液倒入已恒定质量的蒸发皿 (前后质量差小于0.2 mg) 中, 放于水浴锅上80℃挥干溶剂, 再置于电热恒温烘箱内于80℃烘制干燥0.5 h, 取出冷却0.5 h, 即可。参照文献方法计算木鳖子霜的脂肪油含量[14]。
 
2.4 BBD-RSM优选炮制工艺
2.4.1 试验设计与结果
基于“2.1”项木鳖子霜的制备流程, 选取了烘制时间 (A) 、烘制温度 (B) 及压制时间 (C) 3个主要考察因素, 丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯 (Y1) 、β-谷甾醇 (Y2) 、齐墩果酸 (Y3) 含量及脂肪油含量 (Y4) 的指标总评归一值 (OD) 为响应指标, 采用Design-Expert 8.0.5b软件的BBD-RSM试验设计的3因素3水平设计方案。优化实验以所选3因素为自变量, 以总评分OD值为因变量, 建立多元线性回归方程, 并根据拟合模型得出响应面图[15,16,17], 进而优化出最优炮制方案, 试验设计方案与结果见表1。
 
总评分OD值计算步骤: (1) 采用Hassan法对丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯、β-谷甾醇、齐墩果酸及脂肪油含量指标进行归一化处理, 其中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯 (d1) 、β-谷甾醇 (d2) 、齐墩果酸 (d3) 指标值越大越好[d= (Mi-Mmin) / (Mmax-Mmin) ];脂肪油含量 (d4) 指标值越小越好[d= (Mmax-Mi) / (Mmax-Mmin) ]。式中Mi为指标测量值, Mmax和Mmin指每一指标在所有试验中所测得的最大值和最小值。 (2) 将处理所得各指标进行“归一化”, 得总评分OD值, 即OD= (d1×d2×d3×d4) 1/4。
 
2.4.2 模型拟合与方差分析
将表1所得数据导入Design-Expert 8.0.5b软件, 进行多元二项式拟合, 模型拟合及方差分析结果如下:OD=0.49-0.094A-0.10 B+0.26 C-0.068 AB+0.084 AC-0.091BC-0.082 A2-0.095 B2-0.081 C2。
 
表1 BBD试验设计及结果Table 1 Design and results of BBD test     下载原表
 
 表1 BBD试验设计及结果Table 1 Design and results of BBD test
表2结果显示, 模型的P=0.004 9<0.01, 说明所采用的回归模型具有极显著意义, 失拟项的P=0.280 8>0.05, 表明失拟项并不显著, 故该方程拟合的模型可以用于分析木鳖子制霜炮制工艺, 预测最优工艺参数。分析所得相关系数r2=0.916 9, R2adj=0.883 6, 说明该模型与实际情况拟合较吻合;C项P=0.000 2<0.01, 说明达到极显著水平, A、B项的P值均<0.05, 说明具有显著意义, 而AB、AC、BC、A2、B2、C2项均不显著, 故说明单因素对OD值的影响远远超过交互项, 因而不再进行交互作用分析, 且因素影响顺序为C>B>A。
 
2.4.3 响应面法优化最佳制霜工艺
根据“2.4.2”项得到回归模型, 采用Design-Expert8.0.5b软件绘制各因素对OD值的响应曲面图 (图2) 。结果显示, 最佳的工艺条件为A=1.68 h、B=80℃、C=30min, OD=0.777。A=1.68 h即100.8 min, 考虑到实际操作, 将其微调为1.7 h即102 min。故最终优选工艺为烘制时间1.7 h、烘制温度80℃、压制时间30 min。
 
2.4.4 验证实验
根据优选出的最佳工艺平行制备木鳖子霜3份, 按照“2.2.3”项下方法制备样品溶液, 以“2.2.1”项色谱条件进样5μL, 并根据所得样品峰面积, 得出丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯、β-谷甾醇、齐墩果酸含量, 另外按照“2.3”项下提取脂肪油, 计算其含量, 最终计算其OD值, 实验所得结果显示该模型具备较高的准确性和精密性, 所优选的工艺稳定可行, 其验证结果见表3, 其中偏差值=OD-预测值。
 
表2 二次多项式方程模型方差分析Table 2 Variance analysis of quadratic polynomial equation model     下载原表
 
 表2 二次多项式方程模型方差分析Table 2 Variance analysis of quadratic polynomial equation model
 图2 A、B、C对OD值的响应面3D图Fig.2 3D response surface of A, B, and C to OD value
图2 A、B、C对OD值的响应面3D图Fig.2 3D response surface of A, B, and C to OD value   下载原图
 
表3 工艺验证实验结果Table 3 Results of process verification     下载原表
 
 表3 工艺验证实验结果Table 3 Results of process verification
3 讨论
本实验采用BBD-RSM优化木鳖子霜炮制工艺。传统炮制工艺优选大多采用线性数学模型设计的正交试验, 其优点是可以选出多水平、多因素的最佳条件, 但只能分析离散型数据, 且精确度不高, 预测性较差。而响应面法是一种用非线性模型设计的实验方法, 建立了明确的多项式函数来表达因素与响应值之间的联系, 可以精确预测最佳工艺条件;本实验采用此法建立质控指标与关键工艺参数的数学模型, 并运用该模型对最佳工艺结果进行预测, 结果显示预测值与实际值的偏差在2%以内, 表明其相关性良好, 说明对木鳖子霜的炮制工艺进行响应面法优化合理可行。
 
本实验采用HPLC法测定木鳖子霜中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯、β-谷甾醇、齐墩果酸含量, 且木鳖子样品中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯含量均大于0.4%, 符合《中国药典》2015年版不低于0.4%的规定。其木鳖子霜按《中国药典》2015年版记载制备供试品溶液, 其指标成分丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯色谱峰较小, 经实验验证原因是丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯为木鳖子皂苷降解后的次级苷, 需水解处理。
 
通过考察不同色谱柱:Acquty UPLC®BEH C18 (100 mm×2.1 mm, 1.6μm) 、Acquty UPLC®BEHC18 (100 mm×2.1 mm, 1.7μm) 及Agilent TC-C18 (2) (250 mm×4.6 mm, 5μm) 。结果显示, 采用Agilent TC-C18 (2) (250 mm×4.6 mm, 5μm) 色谱柱, 得到的色谱峰分离的较好。本实验还对不同流动相系统、体积流量、柱温及检测波长均进行了考察, 结果表明本实验所采用的检测仪器及方法对木鳖子霜适用性良好。本实验旨在优选木鳖子霜的最佳炮制工艺, 相较于传统炮制工艺, 明显降低了其制作周期, 且具有可控性, 为其质量标准提供了参考依据, 同时为后期实验奠定基础。

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文章名称:Box-Behnken设计-响应面法优化木鳖子霜炮制工艺

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