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基于HIF-1α介导的VEGF mRNA表达探讨膈下逐瘀汤抗肝纤维化血管新生的机制

分类:(二) 发表时间:2019-08-20

血管新生被认为是一些病理条件下肝纤维化的前奏[1], 已有研究表明, 抑制血管新生能有效抑制纤维化的形成[2]。但由于部分药物在抑制血管新生的同时可引起明显的并发症, 导致患者被
血管新生被认为是一些病理条件下肝纤维化的前奏[1], 已有研究表明, 抑制血管新生能有效抑制纤维化的形成[2]。但由于部分药物在抑制血管新生的同时可引起明显的并发症, 导致患者被迫停止药物治疗[3,4], 因此寻找高效、低副作用的抗血管新生药物是目前抗肝纤维化药物研究的重要方向之一。
 
膈下逐瘀汤是清代医家王清任创制的活血祛瘀名方, 主治膈膜下、上腹部瘀血积块等病证, 与肝纤维化、肝硬化的发病机制和部位相符。实验研究证实膈下逐瘀汤可通过多种机制改善大鼠肝纤维化[5,6,7,8], 但没有从血管新生的角度对膈下逐瘀汤抗肝纤维化进行过相关研究。
 
血管内皮细胞生长因子 (VEGF) 是生理和病理情况下血管生成的主要调节者, VEGF与其受体的相互作用是肝纤维化发生的前提条件[9]。缺氧诱导因子-1α (HIF-1α) 作为一种转录因子, 是VEGF基因上游重要表达调控因子[10], 可在基因水平上直接调控VEGF的表达[11,12]。体内细胞在缺乏HIF-1α时VEGF的表达被明显抑制;而在体外的野生型细胞中, 在缺氧环境下VEGF合成增加, HIF-1α引起VEGF增加能刺激肝星状细胞 (HSC) 活化、增殖, 增加微血管生成, 促进细胞外基质 (ECM) 生成及肝脏重构, 还能促进肝窦毛细血管化的形成, 使肝细胞与血浆之间物质交换及肝脏血液循环出现障碍, 从而促进肝纤维化的形成[13]。
 
因此本实验研究膈下逐瘀汤对肝纤维化大鼠HIF-1α、VEGF表达的调节作用, 阐明肝纤维化血管新生与中医“血瘀”证的关系, 对深入认识肝纤维化“血瘀”病机具有重要的理论价值和临床指导意义。
 
1 材料
1.1 实验动物
雄性Wistar大鼠, 108只, 清洁II级, 体质量130~150 g, 购自北京华阜康生物科技有限公司, 许可证号SCXK (京) 2009-0007。大鼠于中国中医科学院广安门医院SPF级动物房饲养, 饲以标准的合成饲料, 自由饮用专用无菌水, 环境温度 (20±2) ℃, 相对湿度36%。
 
1.2 药物与试剂
膈下逐瘀汤按《医林改错》方组成:五灵脂6 g、当归9 g、川芎6 g、桃仁9 g、丹皮6 g、赤芍6 g、乌药6 g、延胡索3 g、甘草9 g、香附5 g、红花9 g、枳壳5 g。所有中药饮片均由广安门医院药剂科统一采购, 均来自康美药业股份有限公司 (批号13056297F) ;N-乙酰半胱氨酸 (NAC, 美国Sigma公司) ;CCl4 (分析纯, 国药集团化学试剂有限公司) ;黑色核染试剂盒、Masson染色试剂盒、哈瑞氏苏木素染液 (北京世济合力生物科技有限公司) ;二抗 (Dako公司) ;Trizol试剂 (Invitrogen公司) ;Fermentas K1622 RT逆转录试剂盒 (MBI公司) ;SYBR Green PCR Master Mix试剂盒 (美国应用生物公司) ;Bradford蛋白浓度测定试剂 (北京天根生化科技有限公司) ;VEGF、β-actin抗体 (Santa Cruz公司) ;VEGFR2抗体 (Abcam公司) 。
 
1.3 仪器
7900HT型荧光定量PCR仪 (美国应用生物公司) ;Thermo NanoDrop 2000分光光度计 (基因有限公司) ;高速冷冻离心机 (Hitachi公司) ;5415R型高速离心机 (德国Eppendorf公司) ;Lambdal P40紫外可见光分光光度仪 (美国PE公司) ;MiniROTEAN3电泳系统、Mini Trans-Blot转移系统 (美国Bio-Rad公司) ;TS-1型脱色摇床 (江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司) ;-80℃冷冻柜 (松下三洋公司) 。
 
2 方法
2.1 分组及给药
参考文献方法[14]选择NAC为对照药物, 大鼠适应性喂养1周, 随机分为对照组、模型组、NAC组及膈下逐瘀汤高 (GD) 、中 (GZ) 、低 (GX) 剂量组, 每组18只。大鼠ip给予50%CCl4-橄榄油溶液1 m L/kg, 每周2次, 共9周, 制备肝纤维化模型[15]。对照组大鼠ip给予等量盐水橄榄油溶液。
 
膈下逐瘀汤采用中国中医科学院广安门医院饮片煎药室统一操作规程煎煮。各组分别于造模同时即给药。对照组及模型组大鼠ig给予等量无菌水10 mL/kg;NAC组ig给予NAC 0.1 g/kg;按药理实验方法学[16]计算大鼠膈下逐瘀汤给药剂量, GD、GZ、GX组大鼠分别ig给予膈下逐瘀汤生药饮片浓煎液26.0、7.8、3.9 g/kg, 每日给药1次。给药按组别分别持续给药3、6、9周。在第3、6、9周时间点, 各组分别随机选取大鼠, 取部分肝组织, 以4%多聚甲醛溶液固定, 制作病理标本。剩余部分肝组织置于液氮中, -80℃保存。
 
2.2 Masson染色
大鼠肝组织石蜡切片3μm, 脱蜡至水, 依次采用黑色核染试剂盒、Masson染色试剂盒染色。95%乙醇-无水乙醇脱水, 二甲苯透明, 中性树胶封固。
 
2.3 肝组织IV型胶原 (Col-IV) 及层黏连蛋白 (LN) 免疫组织化学染色
大鼠肝组织石蜡切片2μm, 经常规脱蜡至水, 蒸馏水洗2次, 磷酸盐缓冲液 (PBS) 漂洗1次, 每次5 min, 高压锅抗原修复, PBS漂洗2~3次, 每次5 min;3%H2O2室温静置10 min;PBS漂洗2~3次, 每次5 min。滴加一抗 (1∶300) 37℃孵育2 h, PBS漂洗3次, 每次5 min;二氨基联苯胺显色3~5 min, 在显微镜下掌握染色程度, 自来水冲洗, 苏木精复染2 min, 盐酸酒精分化, 脱水, 二甲苯透明, 中性树胶封片。图像分析采用病理组织实时摄像显微镜系统摄像, 每个切片随机取4个高倍 (×400) 视野, 并使用图像分析软件 (MIAS) 计算LN和Col-IV平均吸光度 (A) 值。
 
2.4 Real-time PCR检测HIF-1a、VEGF m RNA的相对表达量
取大鼠肝组织, 液氮研磨后Trizol法提取总RNA, 按照SYBR Green PCR Master Mix说明书进行逆转录反应。Real-time PCR反应体系为2×SyBr Green Mix 10μL, 10μmol/L primer L 1μL, 10μmol/L primer R 1μL, DEPC H2O 7μL, cDNA 1μL;反应条件为95℃, 5 min;95℃, 30 s, 55℃, 30 s, 72℃, 35 s, 40个循环;72℃, 8 min。以2-ΔΔCt计算相应m RNA的相对表达量。引物序列见表1。
 
2.5 Western blotting法检测VEGF、VEGFR2蛋白表达量
取50 mg肝组织, 加入冰冷的裂解缓冲液500μL, 冰浴超声3×10 s, 4℃下10 000×g离心5 min, 吸取上清, Bradford法测定蛋白浓度后分装, -80℃保存。加入50μg蛋白样品至0.5 mL离心管中, 加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×SDS。80 V电压电泳30 min, 待样品走出加样孔后, 将电压调至100 V。蛋白湿转至PVDF模, 5%脱脂牛奶封闭1 h, TBST洗模, 将VEGF、VEGFR2抗体以1×TBST稀释至适当浓度 (1∶1 000) , 4℃孵育过夜。HRP偶联二抗室温孵育1 h, TBST洗模3次, 显影并定影, 凝胶图像处理系统分析。
 
表1 引物序列Table 1 Primer sequences     下载原表
 
 表1 引物序列Table 1 Primer sequences
2.6 统计学分析
用SPSS 19.0软件进行统计处理, 结果用表示, 组间HIF-1α、VEGF mRNA表达量及VEGF、VEGFR2蛋白表达量比较采用重复测量设计的方差分析。各组间大鼠肝脏Col-IV、LN MOD值比较采用单因素方差分析。
 
3 结果
3.1 肝脏胶原纤维Masson染色结果
CCl4慢性肝损伤能显著增加大鼠肝组织胶原纤维含量, 导致肝纤维化的形成, NAC和膈下逐瘀汤不同剂量均能不同程度减少CCl4慢性肝损伤模型大鼠肝组织胶原纤维含量, 延缓肝纤维化病理进程。膈下逐瘀汤抗肝纤维化的作用存在剂量依赖性, 随着剂量的增加而增强 (图1) 。
 
3.2 膈下逐瘀汤对大鼠肝脏LN量的影响
与对照组比较, CCl4慢性肝损伤能显著增加大鼠肝细胞外基质LN的表达。与模型组比较, 在造模第9周时, NAC、GD均能有效抑制大鼠肝细胞外基质LN表达。GZ、GX对LN表达未显示出显著的抑制作用。膈下逐瘀汤抑制大鼠肝组织LN的表达具有时间和剂量依赖性, 见图2及表2。
 
3.3 膈下逐瘀汤对大鼠肝脏Col-IV的影响
与对照组比较, CCl4慢性肝损伤能显著增加大鼠肝细胞外基质Col-IV表达。与模型组比较, NAC、GD均能有效抑制大鼠肝细胞外基质Col-IV表达, 尤其是在造模第6、9周时作用最明显。GZ、GX对Col-IV表达的抑制作用不及NAC和GD, 见图3及表3。
 
 图1 各组大鼠肝脏Masson染色病理切片 (×400) Fig.1 Masson staining pathological section of liver tissue of rats in each group (×400)
图1 各组大鼠肝脏Masson染色病理切片 (×400) Fig.1 Masson staining pathological section of liver tissue of rats in each group (×400)   下载原图
 
 图2 各组大鼠肝脏LN免疫组化切片 (×400) Fig.2 Immunohistochemical section of LN of rat liver in each group (×400)
图2 各组大鼠肝脏LN免疫组化切片 (×400) Fig.2 Immunohistochemical section of LN of rat liver in each group (×400)   下载原图
 
表2 膈下逐瘀汤对大鼠肝脏LN量的影响Table 2 Effect of GZD on expression of LN in rat liver     下载原表
 
 表2 膈下逐瘀汤对大鼠肝脏LN量的影响Table 2 Effect of GZD on expression of LN in rat liver
与对照组比较:*P<0.05;与模型组比较:△P<0.05;与NAC组比较:▲P<0.05;与GD组比较:●P<0.05;与GZ组比较:▼P<0.05;与组内第3周比较:☆P<0.05;与组内第6周比较:★P<0.05, 下同*P<0.05 vs control group;△P<0.05 vs model group;▲P<0.05 vs NACgroup;●P<0.05 vs GD group;▼P<0.05 vs GZ group;☆P<0.05 vs three week in group;★P<0.05 vs six week in group, same as below
 
3.4 膈下逐瘀汤对大鼠肝脏HIF-1αm RNA表达的影响
与对照组比较, 模型组大鼠肝组织HIF-1αm RNA表达水平显著提高, NAC、GD和GZ均能有效抑制CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝组织HIF-1α高表达, 其中GD和NAC作用最强。与NAC组比较, GD抑制HIF-1αm RNA表达的作用更稳定, 提示膈下逐瘀汤抑制CCl4诱导的慢性肝损伤大鼠肝组织HIF-1αm RNA表达, 且具有时间和剂量依赖性 (表4) 。
 
3.5 膈下逐瘀汤对大鼠肝脏VEGF m RNA表达的影响
与对照组比较, 模型组大鼠肝组织VEGF mRNA表达水平显著提升, 在造模第6、9周, NAC和GD能有效抑制VEGF m RNA高表达, GZ和GX组作用不明显, 见表5。
 
 图3 各组大鼠肝脏Col-Ⅳ免疫组化切片 (×400) Fig.3 Immunohistochemical section of Col-Ⅳof rat liver in each group (×400)
图3 各组大鼠肝脏Col-Ⅳ免疫组化切片 (×400) Fig.3 Immunohistochemical section of Col-Ⅳof rat liver in each group (×400)   下载原图
 
表3 膈下逐瘀汤对大鼠肝脏Col-Ⅳ量的影响Table 3 Effect of GZD on expression of Col-Ⅳin rat liver     下载原表
 
 表3 膈下逐瘀汤对大鼠肝脏Col-Ⅳ量的影响Table 3 Effect of GZD on expression of Col-Ⅳin rat liver
表4 膈下逐瘀汤对大鼠肝脏HIF-1αm RNA表达的影响Table 4 Effect of GZD on expression of HIF-1αmRNA in rat liver     下载原表
 
 表4 膈下逐瘀汤对大鼠肝脏HIF-1αm RNA表达的影响Table 4 Effect of GZD on expression of HIF-1αmRNA in rat liver
3.6 膈下逐瘀汤对大鼠肝脏VEGF蛋白表达的影响
给药第3周, 与对照组比较, 模型组大鼠肝脏VEGF蛋白表达显著升高 (P<0.05) 。与模型组比较, NAC、GD组大鼠肝脏VEGF蛋白表达显著降低 (P<0.05) 。给药第6、9周, 与模型组比较, NAC、GD、GZ组大鼠肝脏VEGF蛋白表达水平显著降低 (P<0.05) 。提示膈下逐瘀汤和NAC均能抑制CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝组织VEGF蛋白表达, 其中GD与NAC效果相当, 优于GZ, 而GX作用不明显, 见表6及图4。
 
表5 膈下逐瘀汤对大鼠肝脏VEGF m RNA表达的影响Table 5 Effect of GZD on expression of VEGF mRNA in rat liver     下载原表
 
 表5 膈下逐瘀汤对大鼠肝脏VEGF m RNA表达的影响Table 5 Effect of GZD on expression of VEGF mRNA in rat liver
3.7 膈下逐瘀汤对大鼠肝脏VEGFR2蛋白表达的影响
给药第3、6、9周, 与对照组比较, 模型组大鼠肝脏VEGFR2蛋白表达显著升高 (P<0.05) 。与模型组比较, NAC、GD、GZ组大鼠肝脏VEGFR2蛋白表达显著降低 (P<0.05) , 且呈剂量依赖性。说明CCl4致慢性肝损伤大鼠肝组织VEGFR2蛋白表达显著升高, NAC和膈下逐瘀汤均能抑制CCl4致肝纤维化大鼠肝组织VEGFR2蛋白表达, NAC与GD作用相当, 较GZ作用更强。GX对VEGFR2蛋白表达无明显影响。见表7及图4。
 
表6 膈下逐瘀汤对大鼠肝脏VEGF蛋白表达的影响Table 6 Effect of GZD on protein expression of VEGF in rat liver     下载原表
 
 表6 膈下逐瘀汤对大鼠肝脏VEGF蛋白表达的影响Table 6 Effect of GZD on protein expression of VEGF in rat liver
 图4 膈下逐瘀汤对大鼠肝脏VEGF、VEGFR2蛋白表达的影响Fig.4 Effect of GZD on protein expression of VEGF and VEGFR2 in rats liver
图4 膈下逐瘀汤对大鼠肝脏VEGF、VEGFR2蛋白表达的影响Fig.4 Effect of GZD on protein expression of VEGF and VEGFR2 in rats liver   下载原图
 
4 讨论
慢性肝损伤过程中, 肝纤维化继发于肝细胞缺氧与病理性血管生成。VEGF是生理和病理情况下血管生成的主要调节者, 肝硬化发生过程中存在着血管新生, 与VEGF的生成增多有关[17]。在肝纤维化发展过程中VEGF及其受体表达水平均显著升高[18], VEGF与其受体的相互作用是肝纤维化发生的前提条件[9]。可见VEGF在肝纤维化血管新生中具有重要的作用。
 
表7 膈下逐瘀汤对大鼠肝脏VEGFR2蛋白表达的影响Table 7 Effect of Gexiazhuyu Decoction on protein expression of VEGFR2 in rat liver     下载原表
 
 表7 膈下逐瘀汤对大鼠肝脏VEGFR2蛋白表达的影响Table 7 Effect of Gexiazhuyu Decoction on protein expression of VEGFR2 in rat liver
低氧是纤维化形成过程中主要的病理特点[19], HIF-1α在这一病理过程中发挥重要的调节作用, 被称为缺氧应激的“总开关”[20]。在缺氧的情况下, HIF-1α累积, 进而导致血管生成因子的表达增加[21]。缺氧通过上调肝脏VEGF、VEGFR1表达, 促进肝脏微血管生成和Col-Ⅰ、Col-Ⅳ沉积, 直接参与肝纤维化的病理进程[22]。HIF-1α基因表达增加对肝纤维化的血管生成及胶原沉积至关重要, 是一个关键的促肝纤维化因子的调控因子[23,24]。在缺氧环境下, 上皮细胞 (endothelial cell, EC) 通过HIF-1α/VEGF通路上调VEGF、VEGFR的表达, 而在敲除HIF-1α、VEGF基因后, 缺氧刺激并不能诱导VEGFR2表达上调[25]。可见在肝纤维化病理性血管新生的过程中, HIF-1α、VEGF起着十分重要的作用。
 
本研究中, 在造模第3周, 与对照组比较, 模型组大鼠肝脏HIF-1αm RNA表达水平显著升高, 由其调控的下游基因VEGF m RNA和VEGF、VEGFR2蛋白表达水平上调。在病理表现方面, 肝脏的炎症、变性、坏死、纤维化程度随着上述基因表达水平的上调而加重。各组指标演变规律与上述基因表达情况基本一致。提示CCl4造成大鼠慢性肝损伤, 启动了肝组织缺氧应激反应, HIF-1α表达上调, 进而调控其下游一系列基因过表达, 并引起肝脏LN、Col-Ⅳ等细胞外基质沉积的病理效应, 最终进展至肝纤维化、肝硬化。
 
CCl4慢性肝损伤能够诱导大鼠肝脏HIF-1α及其下游基因VEGF、VEGFR的表达上调, 并且HIF-1αmRNA水平与肝纤维化程度呈正相关, 即大鼠肝纤维化程度随着肝组织缺氧程度的加重而加重, 该结论与Corpechot等[22]、Copple等[26]的研究一致。一定观察周期内, 各造模组大鼠肝组织HIF-1α、VEGF m RNA水平和VEGF、VEGFR2蛋白表达水平随着损伤持续时间的延长而升高 (3~6周) , 但继续延长观察周期, NAC和膈下逐瘀汤组HIF-1α、VEGF mRNA和相关蛋白表达水平转而降低, 即在实验的9周时间内, 相关指标并未随着时间的延长而呈线性升高。鉴于本研究只观察了第3、6、9周3个时间点, 各指标具体的变化拐点仍需要进一步研究。治疗组相关基因m RNA表达水平显著低于模型组, 提示膈下逐瘀汤、NAC能够改善肝脏的缺氧状态, 有抑制肝脏病理性血管生成作用。
 
肝纤维化时肝脏血管新生对血液的运行造成了影响, 破坏了肝脏正常的生理功能, 符合中医“血瘀”病理表现。而相关的研究也表明“血瘀”是肝纤维化基本证候之一[27], 几乎伴随着肝纤维化整个病程。膈下逐瘀汤是治疗肝纤维化、肝硬化等“血瘀证”的经典方剂。本研究基于HIF-1α介导的缺氧应激损伤及肝纤维化血管生成相关指标, 探讨膈下逐瘀汤改善肝纤维化“血瘀证”的分子生物学机制, 在一定程度上阐释了肝纤维化中医血瘀病机的分子生物学基础, 从现代医学角度丰富了中医“血瘀”理论。

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文章名称:基于HIF-1α介导的VEGF mRNA表达探讨膈下逐瘀汤抗肝纤维化血管新生的机制

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