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四跨膜蛋白CD151调节结直肠癌Notch相关信号通路的研究

分类:(三) 发表时间:2019-08-11

研究表明, 作为四跨膜蛋白tetraspanin家族成员, CD151参与多种实体瘤的浸润与转移过程, 如结直肠癌、胃癌、乳腺癌、食管癌等[1~4]。在众多的致癌因素中, 信号通路的异常变化是早期癌变
 
研究表明, 作为四跨膜蛋白tetraspanin家族成员, CD151参与多种实体瘤的浸润与转移过程, 如结直肠癌、胃癌、乳腺癌、食管癌等[1~4]。在众多的致癌因素中, 信号通路的异常变化是早期癌变的重要途径。Notch信号级联通路与肿瘤的发生发展密切相关[5~7]。在结直肠癌发生发展过程, CD151是否参与了Notch通路的调节作用至今仍然不明确。
 
 
本研究通过TCGA数据库分析CD151的表达与结直肠癌患者生存期间的关系;并在结直肠癌患者癌与癌旁组织和人结肠癌细胞系中, 通过分子生物学方法研究CD151对Notch通路的作用及影响, 以进一步阐明CD151在结直肠癌中的作用机制, 为结直肠癌的临床诊治提供实验依据。
 
1 材料与方法
 
1.1 材料
 
1.1.1 细胞
 
 
结肠癌细胞HT29、HT29-MOCK (慢病毒空载体细胞) 和HT29-CD151-KD (低表达CD151慢病毒载体细胞) 由美国俄克拉荷马大学医学中心惠赠。HT29-MOCK (慢病毒空载体细胞) 中空白对照的RNAi序列为GCGAGACCATGCCTCCAACAT, HT29-CD151-KD (低表达CD151慢病毒载体细胞) 中低表达CD151的RNAi序列为AGTACCTGCTGTTTACC-TACA[8]。
 
1.1.2 临床资料
 
 
本实验中所用的40例大肠癌标本取自2016年8~11月于河北医科大学第四医院外二科确诊为结直肠癌的患者, 男性23例, 女性17例;中位年龄64岁。所有患者术前病理活检诊断均为结直肠癌。其中术后病理分期Ⅰ期2例, Ⅱ期18例, Ⅲ期16例, Ⅳ期4例。
 
1.1.3 实验试剂
 
 
CD151、Notch-1、Hes-1、Jagged-1抗体和β-actin抗体购自美国Abcom公司。
 
1.2 方法
 
1.2.1 癌症基因组图谱数据库 (TCGA) 中的CD151数据资料收集与处理
 
 
OncoLnc网站 (http://www.oncolnc.org) 下载TCGA数据库 (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/) 并预处理结肠癌和直肠癌患者数据集的mRNA表达数据。通过Log-rank (Mantel-Cox) 分析CD151表达水平与预后的相关性。
 
1.2.2 对结直肠癌、癌旁组织和细胞进行Western blot分析
 
 
按每20mg组织加入150~250μl RIPA裂解液比例加入冻存管中。将冻存管放入液氮冷冻30min, 待装有组织和裂解液的冻存管凝固时, 取出加入研磨球后, 放入高通量组织研磨器中, 50Hz研磨裂解1min, 裂解完全吸取溶液转移至另一离心管中, 10 356r/min离心10min, 取上清, -80℃保存。细胞直接用按每20mg加入150~250μl RIPA裂解液比例进行裂解提取蛋白。
 
 
将等量的变性完成的蛋白置于电泳槽中进行分离, 观察分离胶中Marker的位置, 当所需蛋白条带完全分离时, 停止电泳。以蛋白Marker定位将样品所在凝胶切下, 按照凝胶大小剪裁PVDF膜及6层滤纸, 电转仪上自阴极至阳极依次铺制:海绵、三层滤纸、胶、PVDF膜、三层滤纸、海绵, 进行转印。转印完毕的PVDF膜浸泡在封闭缓冲液 (5%脱脂奶粉) 中, 室温封闭1h;对应蛋白条带的一抗 (1∶500稀释) 滴在PVDF膜的蛋白面上, 4℃孵育过夜;1×TBST洗膜3次, 每次10min;再以对应一抗的荧光二抗 (1:5000稀释) 孵育PVDF膜, 37℃孵育1h, 1×TBST洗膜3次, 每次10min;用成像仪扫描成像保存, 使用Odyssey软件进行灰度分析CD151以及Notch信号通路中的重要因子Notch-1、Hes-1和Jagged-1的蛋白表达。
 
1.2.3 对结直肠癌、癌旁组织和细胞进行实时定量聚合酶链反应 (qRT-PCR) 
 
 
将细胞或者组织块加入Trizol, 室温放置10min, 使其充分裂解。按300μl氯仿/ml Trizol量加入氯仿, 震荡混匀后室温放置15min, 4℃, 10 356r/min离心15min。小心吸取上层水相, 至另一离心管中, 按500μl异丙醇/ml Trizol量加入异丙醇混匀, 室温放置10min, 4℃, 10 356r/min离心10min。弃上清, RNA沉于管底, 按1ml 75%乙醇/ml Trizol量加入75%乙醇, 温和震荡离心管, 悬浮沉淀。4℃, 8460r/min离心5min, 弃尽上清通风厨挥干5min。25μl DEPC水溶解, 55℃, 5min, 得到mRNA。
 
 
选择纯度均在260/280在1.8~2.0之间的mR-NA采用Themo逆转录合成试剂盒合成cDNA, 再利用SYBR qRT-PCR) 试剂盒测定基因[引物序列详见表1 (Table 1) ]的表达量, 再用2-△△CT法求算CD151、Notch-1、Hes-1和Jagged-1的基因表达量。△CT=CT目的基因-CTβ-actin, △△CT=△CT实验组-△CT对照组。用2-△△CT表示实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数, 当2-△△CT>1时, 表明实验组目的基因表达上调, 当2-△△CT<1时, 表明实验组目的基因表达下降。
 
1.3 统计学处理
 
 
采用Origin 7.5软件进行统计分析, 实验所有数据均以平均值±标准误来表示。采用单因素方差分析进行组间的比较。P<0.05为差异有统计学意义, P<0.01为差异有极显著统计学意义。
 
2 结果
 
2.1 癌症基因组图谱数据库 (TCGA) 中CD151表达与结直肠癌患者生存关系分析
 
 
利用OncoLnc网站 (http://www.oncolnc.org) 下载TCGA数据库 (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/) 的结肠癌和直肠癌患者数据, 通过数据的预处理, 我们选择存活期在2000d之内的结肠癌和直肠癌患者共559例 (高表达CD151的患者为504例) 进行CD151表达与结直肠癌患者生存关系分析。Logrank (Mantel-Cox) 分析表明高表达CD151的结直肠癌患者生存期显著低于低表达CD151的结直肠癌患者 (P=0.0017) (Figure 1) 。
 
2.2 CD151、Notch-1、Jagged-1和Hes-1在结直肠癌组织中的表达
 
 
Western blot (Figure2) 和qRT-PCR (Figure 3) 的结果表明, 结直肠癌患者组织中CD151、Notch-1、Jagged-1和Hes-1的蛋白和m RNA的表达明显高于癌旁组织。qRT-PCR (Figure 3) 的结果表明, 不同病理分期的结直肠癌组织中, CD151、Notch-1、Jagged-1和Hes-1的m R-NA水平均高于癌旁组织。
 
2.3 CD151、Notch-1、Jagged-1和Hes-1在结肠癌细胞中的表达
 
 
Western blot (Figure4) 和qRT-PCR (Figure 5) 的结果表明, CD151低表达的HT29-CD151-KD细胞中Notch-1、Jagged-1和Hes-1的表达量明显低于HT29和HT29-MOCK细胞。
 
 
Table 1 The sequence of primers     下载原表 
Table 1 The sequence of primers  
3 讨论
 
 
CD1151又名血小板内皮细胞四跨膜蛋白抗原3 (pletelet-endothelial cell tretraspanin antigen3, PETA-3) 或SFA-1, 是首次被发现的四跨膜超家族蛋白 (TM4SF) 的癌基因。有研究发现, CD151在不同组织与细胞中与不同的整合素 (a3b1、a5b1、a6b1、a6b4等) 结合可促进多种实体肿瘤的浸润和转移, 如结直肠癌、胃癌、乳腺癌、食管癌等[2~4]。但具体机制尚未明确。研究表明, 多种信号通路参与了CD151有关的肿瘤作用机制。CD151可通过PI3K/Akt/GSK-3beta/Snail信号通路调节MMP9对肝细胞癌的促进作用。CD151与整合素α3β1结合通过上皮间质转化作用和Wnt通路调节卵巢癌的生长[3]。CD151通过促进血管生成及血运重建从而发挥其促进肿瘤侵袭及转移的作用[4]。有研究发现, Notch-1与其配体Jagged-1促进了肿瘤组织周围VEGF的表达, Jagged1-Notch信号通路参与了肿瘤新生血管的生成[6]。Notch-1及其mRNA过表达可作为结直肠癌非依赖性预后指标。Notch-1的表达与结直肠肿瘤的进展、肿瘤的病理分级、转移、抑制细胞凋亡、促进细胞增殖有关[6,7]。
 
Figure 1 The relation between CD151 and the survival of patients with colorectal cancer  
Figure 1 The relation between CD151 and the survival of patients with colorectal cancer   下载原图
 
 
Figure 2 The protein expressions of CD151, Notch-1, Jagged-1 and Hes-1 in colorectal cancer tissues and cancer adjacent tissues by Western blot analysis  
Figure 2 The protein expressions of CD151, Notch-1, Jagged-1 and Hes-1 in colorectal cancer tissues and cancer adjacent tissues by Western blot analysis   下载原图
 
 
Note:*:Compared with cancer tissues, P<0.05.
 
 
我们的研究发现, CD151、Notch-1、Jagged-1以及Hes-1的蛋白和mRNA水平在结直肠癌患者癌组织中的表达明显高于癌旁组织, 推测CD151与Notch信号通路均可能参与了结直肠癌的侵袭过程。有研究表明, 在结直肠癌初期CD151的表达增加, 随着肿瘤的侵袭和转移, CD151的表达下降, 其机制可能与整合素依赖的内皮细胞间作用和缺氧诱导因子 (HIF-1) 有关[9,10]。我们的结果也表明随着病理分期的进展, 在结直肠癌Ⅳ期, CD151 mRNA的表达略有下降。Notch-1、Jagged-1以及Hes-1 mRNA的表达也呈类似下降的趋势。由于本实验患者样本有限, CD151与Notch通路基因的表达仍需要增加临床患者的样本进一步证实。
 
Figure 3 The mRNA expressions of CD151, Notch-1, Jagged-1 and Hes-1 in colorectal cancer tissues and cancer adjacent tissues in patients with different pathological stages  
Figure 3 The mRNA expressions of CD151, Notch-1, Jagged-1 and Hes-1 in colorectal cancer tissues and cancer adjacent tissues in patients with different pathological stages   下载原图
 
 
Notes:*:P<0.05;**:P<0.01.
 
Figure 4 Knockdown the expression of CD151 downregulated protein expressions of CD151, Notch-1, Jagged-1 and Hes-1 in HT29 cells group compared with normal HT29 cells group and MOCK HT29 cells group examined by Western blot analysis  
Figure 4 Knockdown the expression of CD151 downregulated protein expressions of CD151, Notch-1, Jagged-1 and Hes-1 in HT29 cells group compared with normal HT29 cells group and MOCK HT29 cells group examined by Western blot analysis   下载原图
 
 
Note:*:P<0.05.
 
Figure 5 Knockdown the expression of CD151 downregulated mRNA expressions of CD151, Notch-1, Jagged-1 and Hes-1 in HT29 cells group compared with nomal HT29 cells group and MOCK HT29 cells group examined by qRT-PCR  
Figure 5 Knockdown the expression of CD151 downregulated mRNA expressions of CD151, Notch-1, Jagged-1 and Hes-1 in HT29 cells group compared with nomal HT29 cells group and MOCK HT29 cells group examined by qRT-PCR   下载原图
 
 
Notes:*:P<0.05;**:P<0.01.
 
 
同时, 我们实验表明:在CD151低表达的HT29细胞株中Notch-1、Jagged-1以及Hes-1的蛋白和mRNA水平与对照组相比明显降低。提示, CD151在结肠癌中可能对Notch通路起一定的调控作用。CD151通过哪些关键环节作用于Notch通路以及CD151在结直肠癌的作用靶点还需更深入的研究。
 

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文章名称:四跨膜蛋白CD151调节结直肠癌Notch相关信号通路的研究

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