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白三七及近源种药材指纹图谱与识别模式的构建及其应用研究

分类:(三) 发表时间:2019-08-19

白三七又名竹节参、竹节七、竹节人参等, 为五加科人参属植物竹节参Panax japonicus C.A.Mey.的干燥根茎[1], 收载于《中国药典》2015年版一部, 是我国西南地区民间常用中草药, 被土家族、苗
白三七又名竹节参、竹节七、竹节人参等, 为五加科人参属植物竹节参Panax japonicus C.A.Mey.的干燥根茎[1], 收载于《中国药典》2015年版一部, 是我国西南地区民间常用中草药, 被土家族、苗族居民视为“草药之王”, 属珍稀濒危的名贵“七类”中药[2], 兼具北药人参滋补强壮和南药三七活血化瘀的功效[3]。
 
目前, 《中国药典》2015年版对白三七药材仅简单记载了其性状、鉴别、水分和总灰分检查。为了更好地深入挖掘与应用这一珍稀濒危的名贵的“草药之王”, 深度开发“七类”中药, 丰富民族药物的临床应用内涵, 提高民族药物现代质量控制势在必行。指纹图谱研究是中药现代质量控制方法之一, 能够提供复杂的多组分分布的全局和基本信息, 具有进一步鉴别、鉴定和分类的潜力[4];同时也符合中药多成分综合作用的特点。而文献研究中关于白三七指纹图谱的分析缺乏定量参数特征[5,6], 而总量统计矩法将指纹图谱作为众多高斯曲线叠加而成的概率密度函数曲线, 用统计学的方法来分析指纹图谱的内在特征, 按一维随机向量统计原理, 用总量零阶矩 (AUCT) 、总量响应率 (AUCPWT) 、总量一阶矩 (MCRTT) 、总量二阶矩 (VCRTT) 4个参数进行全面的定性定量研究[7,8]。
 
白三七、人参、三七、西洋参和扣子七均来源于五加科人参属, 为亲缘关系相近的5种植物, 在化学成分上十分相似, 均含人参皂苷类成分, 但其皂苷类成分的类型和含量差异明显[9]。本研究采用HPLC法建立白三七指纹图谱并计算总量统计矩参数, 采用总量统计矩法、夹角余弦法和相关系数法进行相似度评价, 结合聚类分析与主成分分析进行分类识别;并将构建的指纹图谱统计矩参数识别方法应用于五加科人参属药材鉴定, 为白三七质量评价及与同科同属5种药材区分提供理论依据。
 
1 仪器与试药
1.1 仪器
Waters e2695型高效液相仪, Waters 2489 UV检测器, Empower 3色谱数据工作站 (美国Waters公司) ;LE204E/02型电子天平 (上海梅特勒-托利多有限公司) ;Option R7 utra AN超纯水系统 (英国ELGA LabWaters公司) ;粉碎机 (浙江省永康市金穗机械制造厂) ;DZKW-4型双列六孔水浴锅 (北京中兴伟业仪器有限公司) 。
 
1.2 试药
10批不同产地白三七及其他五加科人参属药材信息见表1, 经湖南中医药大学龚力民副教授鉴定为五加科人参属植物竹节参Panax japonicus C.A.Mey.的干燥根茎;珠子参Panax japonicus C.A.Mey.var.major (Burk.) C.Y.Wu et K.M.Feng或羽叶三七Panax japonicus C.A.Mey.var.bipinnatifidus (Seem.) C.Y.Wu et K.M.Feng的干燥根茎 (扣子七) ;人参Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根和根茎;三七Panax notoginseng (Burk.) F.H.Chen的干燥根和根茎;西洋参Panax quinquefolium L.的干燥根。对照品人参皂苷Rg1 (批号wkq15121303) 、人参皂苷Re (批号wkq16081605) 、人参皂苷Rb1 (批号wkq16060402) 均购于四川省维克奇生物科技有限公司, 质量分数均≥98%;竹节参皂苷V (批号HG027158198) 、竹节参皂苷IV (批号HA305950198) 、竹节参皂苷IVa (批号HC027157198) 均购于宝鸡市辰光生物科技有限公司, 质量分数均为98%;乙腈、甲醇 (色谱纯, 均购于德国默克股份有限公司) ;磷酸 (分析纯, 国药集团化学试剂有限公司) ;实验用水均为超纯水。
 
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱:Venusil XBP C18 (250 mm×4.6 mm, 5μm) ;流动相为乙腈 (A) -0.1%磷酸水溶液 (B) , 梯度洗脱, 0~5 min, 2%A;5~35 min, 2%~15%A;35~39 min, 15%~21%A;39~60 min, 21%A;60~66 min, 21%~27%A;66~71 min, 27%~32%A;71~105 min, 32%~35%A;体积流量1.2 mL/min;检测波长为203 nm;柱温35℃;进样量10μL。
 
表1 样品信息Table 1 Sample information     下载原表
 
 表1 样品信息Table 1 Sample information
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备
精密称取人参皂苷Rg1、Re、Rb1及竹节参皂苷V、IV、IVa各对照品约10 mg, 分别置于10 mL量瓶中, 加甲醇适量使溶解, 稀释至刻度, 摇匀, 贮存于4℃条件下, 备用。
 
2.2.2 供试品溶液的制备
取白三七及其他4种五加科人参属药材 (40目筛) 1 g, 精密称定, 置于具塞锥形瓶中, 加70%甲醇50 mL, 称定质量, 加热回流提取1 h, 放冷, 再称定质量, 用70%甲醇补足减失的质量, 摇匀, 用0.45μm的微孔滤膜滤过, 即得供试品溶液。
 
2.3 方法学考察
2.3.1 精密度试验
取白三七药材 (S7) , 按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液, 按“2.1”项下的色谱条件连续进样6次, 测得各相对保留时间与相对峰面积, 计算其RSD。以竹节参皂苷V (11号峰) 为参照峰, 结果各相对保留时间的RSD均小于0.29%, 各相对峰面积的RSD均小于1.92%, 表明仪器精密度良好。
 
2.3.2 稳定性试验
取白三七药材 (S7) , 按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液, 分别于0、2、4、6、8、10、24 h按“2.1”项下的色谱条件进行测定, 测得各相对保留时间与相对峰面积, 计算其RSD。结果各相对保留时间的RSD均小于0.35%, 各相对峰面积的RSD均小于1.97%。表明供试品溶液在24 h内稳定。
 
2.3.3 重复性试验
取白三七药材 (S7) 6份, 精密称定, 分别按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液, 按“2.1”项下的色谱条件进行测定, 测得各相对保留时间与相对峰面积, 计算其RSD。结果各相对保留时间的RSD均小于0.28%, 各相对峰面积的RSD均小于2.74%, 表明方法重复性良好。
 
2.4 指纹图谱的建立
2.4.1 指纹图谱共有模式的建立
将不同产地白三七药材的色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A》软件, 选定S9号样品为参照图谱, 设定时间漂移值为0.3, 采用中位数法自动匹配生成对照图谱, 叠加图谱及对照图谱结果见图1。由图1可知, 共获得16个共有峰;经与对照品溶液色谱图对比后, 指认了其中6个共有峰:人参皂苷Rg1 (7号峰) 、人参皂苷Re (8号峰) 、人参皂苷Rb1 (9号峰) 、竹节参皂苷V (11号峰) 、竹节参皂苷IV (15号峰) 及竹节参皂苷IVa (16号峰) ;其中11号峰 (竹节参皂苷V) 峰面积所占比例较大且相对稳定, 分离度较好, 因此确定其为参照峰 (S) 。
 
 图1 不同产地白三七样品指纹图谱 (A) 、对照图谱 (R) 与混合对照品HPLC图 (B) Fig.1 HPLC fingerprint of Panacis japonici Rhizoma from different regions (A) , control fingerprint (R) and chromatogram of mixed standards (B)
图1 不同产地白三七样品指纹图谱 (A) 、对照图谱 (R) 与混合对照品HPLC图 (B) Fig.1 HPLC fingerprint of Panacis japonici Rhizoma from different regions (A) , control fingerprint (R) and chromatogram of mixed standards (B)   下载原图
 
7-人参皂苷Rg1 8-人参皂苷Re 9-人参皂苷Rb1 11-竹节参皂苷V 15-竹节参皂苷IV 16-竹节参皂苷IVa7-ginsenoside Rg1 8-ginsenoside Re 9-gnsenoside Rb111-chikusetsusaponin V 15-chikusetsusaponin IV16-chikusetsusaponin IVa
 
2.4.2 共有峰的相对保留时间与相对峰面积
以各产地样品中的11号峰 (竹节参皂苷V) 为参照峰, 计算同一样品中各共有峰的相对保留时间与相对峰面积, 结果见表2、3, 由表2可知, 共有峰相对保留时间的波动较小, 而相对峰面积波动较大, 表明白三七指纹图谱中主要峰群的整体面貌基本一致, 但各成分含有量差别较大。
 
2.4.3 总量统计矩分析
根据指纹图谱的一种定性定量研究新方法[7]—总量统计矩法分析不同产地的白三七样品, AUCT、AUCPWT、MCRTT、VCRTT结果见表4。不同产地白三七的指纹图谱的总量统计矩参数表明不同产地白三七样品在“量”上具有一定的差异性。
 
2.4.4 相似度分析
分别采用总量统计矩法、夹角余弦法、相关系数法[10]对10批不同产地白三七样品的HPLC指纹图谱进行相似度评价, 其结果见表5~7, 总量统计矩法计算的相似度范围为0.921~0.961、夹角余弦法和相关系数法计算的相似度除了S7 (产地四川大凉山) 外均在0.90以上, 3种相似度评价结果均表明各产地白三七样品的质量相对稳定, 在“形”上具有一定的相似性。
 
表2 各共有峰的相对保留时间Table 2 Relative retention time of common peaks     下载原表
 
 表2 各共有峰的相对保留时间Table 2 Relative retention time of common peaks
表3 各共有峰的相对峰面积Table 3 Relative peak area of common peak     下载原表
 
 表3 各共有峰的相对峰面积Table 3 Relative peak area of common peak
表4 不同产地白三七样品的总量统计矩参数Table 4 Parameters of total quantum statistical matix of samples from different regions     下载原表
 
 表4 不同产地白三七样品的总量统计矩参数Table 4 Parameters of total quantum statistical matix of samples from different regions
表5 总量统计矩法计算不同产地白三七样品的相似度Table 5 Similarities of samples from different regions by total statistical matix method     下载原表
 
 表5 总量统计矩法计算不同产地白三七样品的相似度Table 5 Similarities of samples from different regions by total statistical matix method
表6 夹角余弦法计算不同产地白三七样品的相似度Table 6 Similarities of samples from different regions by cosine method     下载原表
 
 表6 夹角余弦法计算不同产地白三七样品的相似度Table 6 Similarities of samples from different regions by cosine method
表7 相关系数法计算不同产地白三七样品相似度Table 7 Similarities of samples from different regions by correlation coefficients     下载原表
 
 表7 相关系数法计算不同产地白三七样品相似度Table 7 Similarities of samples from different regions by correlation coefficients
2.5 各产地白三七样品的聚类分析
聚类分析是通过将观察对象依据某些特征加以归类, 从而建立样本与样本之间的相似关系或亲疏关系的一种探索性数据分析手段, 目前已广泛应用于中药鉴别、质量评价和品种分类等方面[11]。采用SPSS 19.0软件, 以10个不同产地的白三七药材的16个共有峰峰面积为变量, 选用组间联接法, Euclidean距离为测度, 进行聚类, 聚类结果见图2。由图2可知, 当类间距离为10~15时, 白三七药材可以聚为3类, 其中S4、S8、S9为一类, S1、S2、S3、S5、S6、S10为一类, S7 (产地四川大凉山) 为单独一类, 观察各共有峰相对峰面积可发现, S7有较多色谱峰 (如7、14与16号峰等) 高于其他产地, 提示这可能是造成差异的原因之一。
 
 图2 不同产地白三七样品聚类分析Fig.2 Cluster analysis of Panacis Japonici Rhizoma from different regions
图2 不同产地白三七样品聚类分析Fig.2 Cluster analysis of Panacis Japonici Rhizoma from different regions   下载原图
 
2.6 各产地白三七样品的主成分分析
为了更直接地评价16个共有成分对样品的分辨能力, 将10个不同产地的白三七药材的16个共有峰的峰面积导入SPSS 19.0, 对共有峰峰面积进行标准化处理, 进行主成分分析。主成分个数提取原则为主成分的特征值大于1的前m个主成分。经计算可得, 前4个主成分的特征值大于1, 即7.169、3.520、1.913、1.574, 对方差的贡献率分别为44.806%、21.999%、11.959%、9.839%, 累积贡献率为88.603%, 见表8。从图3可见, 前3个成分较陡, 剩余的其他成分之间比较平缓, 又因前3个主成分的特征值相对较大, 故选择前3个主成分能反映白三七药材中化学成分的基本特征。分别以PC1、PC2、PC3建立坐标系进行投影, 得到不同产地白三七样品的主成分三维分布图 (图4) 。由图4可知, S4、S8、S9为一类, S1、S2、S3、S5、S6、S10为一类, S7号样品 (产地四川大凉山) 与其他样品投影点相距较远为单独的一类, 其结果与聚类分析一致。
 
表8 白三七PCA的特征值与贡献率Table 8 Eigenvalue and contribution rate of PCA of Panacis Japonici Rhizoma     下载原表
 
 表8 白三七PCA的特征值与贡献率Table 8 Eigenvalue and contribution rate of PCA of Panacis Japonici Rhizoma
 图3 白三七主成分分析碎石图Fig.3 PCA scree plot of Panacis Japonici Rhizoma
图3 白三七主成分分析碎石图Fig.3 PCA scree plot of Panacis Japonici Rhizoma   下载原图
 
 图4 不同产地白三七药材主成分3D得分图Fig.4 3D PCA score of Panacis Japonici Rhizoma from different regions
图4 不同产地白三七药材主成分3D得分图Fig.4 3D PCA score of Panacis Japonici Rhizoma from different regions   下载原图
 
2.7 各产地白三七样品的质量波动分析
为了探究各产地样品之间的质量波动, 根据文献方法引入参数P值[12], 对不同产地的白三七药材质量进行评价, 计算公式为P=给定化合物的测定浓度/平均浓度, P值越接近1, 批间的一致性越好。一般来说, P值在0.75~1.25是可以接受的[13]。从图5 Box-chart图可知, 只有竹节参皂苷V (11号峰) 和竹节参皂苷IV (15号峰) 在范围内, 说明了这2个成分在不同批次白三七样品中的质量波动范围较小;由图1可知, 竹节参皂苷V (11号峰) 和竹节参皂苷IV (15号峰) 是白三七的2个主要的色谱峰。
 
2.8 白三七指纹图谱模式在五加科人参属药材中的应用
2.8.1 指纹图谱共有模式的建立
将所得色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A》软件, 建立五加科人参属药材的指纹图谱共有模式, 结果见图6, 白三七和扣子七2个样品色谱图较相似, 含有指认的人参皂苷Rg1、Re与Rb1及竹节参皂苷V与竹节参皂苷IVa色谱峰, 未指认的色谱峰也较多的同时出现在2个样品中, 可知竹节参皂苷IV为白三七独有特征峰;另外人参属5种药材均含有指认的人参皂苷Rg1、Re与Rb1。
 
 图5 16个共有峰Box-chart图Fig.5 Box chart of 16 common peaks of Panacis Japonici Rhizoma from different regions
图5 16个共有峰Box-chart图Fig.5 Box chart of 16 common peaks of Panacis Japonici Rhizoma from different regions   下载原图
 
 图6 五加科人参属5种药材HPLC指纹图谱Fig.6 HPLC fingerprint of five herb medicines of Panax genus
图6 五加科人参属5种药材HPLC指纹图谱Fig.6 HPLC fingerprint of five herb medicines of Panax genus   下载原图
 
2.8.2 总量统计矩参数分析
总量统计矩分析法分析五加科人参属药材样品总量统计矩参数, 其结果见表9, 5种药材指纹图谱的总量统计矩存在较大的差异, AUCT、AUCPWT及MCRTT的大小顺序为扣子七>白三七>三七>西洋参>人参;VCRTT的大小顺序为人参>西洋参>扣子七>白三七>三七。
 
3 讨论
3.1 实验条件的优化
本实验在供试品溶液的制备中, 对不同的提取溶剂 (甲醇、50%甲醇、70%甲醇、70%乙醇、20%乙腈) 、提取方式 (超声与回流) 、提取时间 (30、45、60、90 min) 进行考察, 最终确定了70%甲醇加热回流提取60 min作为供试品溶液的制备方法;考察了不同流动相 (0.05%磷酸、0.05%醋酸、0.1%甲酸、超纯水) , 不同体积流量 (0.8、1.0、1.2m L/min) 、不同的色谱柱温度 (25、30、35℃) 、不同色谱柱[Waters Sun Fire TM C18 (250 mm×4.6mm, 5μm) 、Agilent TC-C18 (250 mm×4.6 mm, 5μm) 、Venusil MP C18 (250 mm×4.6 mm, 5μm) 、Waters Symmetry C18 (250 mm×4.6 mm, 5μm) ]对指纹图谱的影响, 最终确定色谱条件为水相为0.05%磷酸, 体积流量为1.2 m L/min, 色谱柱温度35℃, Venusil MP C18 (250 mm×4.6 mm, 5μm) 色谱柱, 此条件下基线平稳, 色谱峰峰形较好、分离效果较佳。
 
表9 五加科人参属5种药材的总量统计矩参数Table 9 Parameters of total quantum statistical moment of five herb medicines from Panax genus     下载原表
 
 表9 五加科人参属5种药材的总量统计矩参数Table 9 Parameters of total quantum statistical moment of five herb medicines from Panax genus
3.2 白三七指纹图谱识别分析
本实验采用HPLC法建立了10批来自不同产地的白三七药材指纹图谱, 同时建立了5种五加科人参属药材指纹图谱, 白三七药材共标定了16个共有峰, 并通过化学对照品指认了其中6个化学成分:人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、竹节参皂苷V、竹节参皂苷IV、竹节参皂苷IVa。
 
在指纹图谱识别模式中采用同时具有定性定量方法之总量统计矩法, 其具有以下特点: (1) 抗干扰性, 可以降低测试方法的要求, 对各峰的分离状态、形状、重现性、稳定性、共有与非共有没有严格的要求; (2) 加合性, 能用来消除仪器的干扰; (3) 偶联性, 能与多维向量偶联构成多维曲线中心矩及偏差分析。通过计算总量统计矩参数AUCT、AUCPWT、MCRTT、VCRTT、AUCT, 得到定量数值, 四川大凉山产地值偏大, 湖北神农架、四川雅安与乐山产地值较相近, 贵州贵阳、湖北恩施、湖南石门、江西吉安、云南丽江产地值较相近, 其结果与聚类分析与主成分分析的分类一致。
 
实验中同时采用夹角余弦法、总量统计矩法和相关系数法评价不同产地白三七样品的相似度, 发现除四川大凉山产地药材外, 具有较高的相似度。另外, 在白三七指纹图谱评价中首次引用质量波动评价的P值分析, 全面评价各色谱峰对质量波动的影响, 发现除了竹节参皂苷V (11号峰) 和竹节参皂苷IV (15号峰) 外, 其他色谱峰在各样品中的波动较大, 这可能与生长环境、土壤条件、采收时间、加工方式等因素有关。构建的指纹图谱及识别模式应用于五加科人参属5种药材的鉴别研究, 在“形”上可判别白三七和扣子七2个样品较相似, 在“量”上5种药材的总量统计矩参数差异较大, 研究表明本实验建立的方法简便、准确、可靠, 可为白三七的质量评价和标准的制定以及同科同属药材的区分鉴别提供科学依据。

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文章名称:白三七及近源种药材指纹图谱与识别模式的构建及其应用研究

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