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茉莉酸甲酯对艾纳香活性成分、抗氧化酶活力以及内源激素含量的影响

分类:(三) 发表时间:2019-08-19

艾纳香Blumea balsamifera L.DC.又名大风艾、冰片艾, 为菊科艾纳香属多年生木质草本植物, 被列为十大苗药之一, 主要分布在我国海南、贵州、广西、广东、云南、台湾等地。艾纳香也是提取
艾纳香Blumea balsamifera L.DC.又名大风艾、冰片艾, 为菊科艾纳香属多年生木质草本植物, 被列为十大苗药之一, 主要分布在我国海南、贵州、广西、广东、云南、台湾等地。艾纳香也是提取天然冰片 (艾片) 的主要来源。现代药理学研究证实, 艾纳香中的L-龙脑具有抗炎、抗氧化、镇痛、促进药物吸收、提神醒脑等作用, 并且在精致艾片过程中所产生的艾油具有扩张血管、降低血压、抑制交感神经的作用, 因而被广泛应用于医药行业[1]。同时, 因艾油有独特的气味, 也被广泛应用于香料及化妆品等行业。
 
以茉莉酸 (jasmonic acid, JA) 和茉莉酸甲酯 (methyle jasmonate, MeJA) 为代表的茉莉素类物质 (jasmonates, JAs) 是一种常见的植物生长调节剂, 广泛存在于自然界中, 在植物损伤信号防御反应中起着重要的作用。通过研究MeJA对茶树[2]、丹参[3]、番茄[4]、水稻[5]等多种高等植物次生代谢产物和抗逆性的影响表明, MeJA对提高作物的品质和增强抗逆反应等方面具有显著的作用。因此, 目前已将MeJA作为常用的外源生长调节剂, 在大田栽培生产过程中广泛应用。植物内源激素是指植物体内自身代谢产生的调控生长发育的物质, 目前科学界公认的6大类植物激素有生长素 (auxins) 、赤霉素 (gibberenllins, GA) 、细胞分裂素类 (cytokinins, CK) 、乙烯 (ethylene) 、脱落酸 (abscisic acid, ABA) 、油菜素甾醇类 (brassinosteroids, BRs) [6], 其作用在于调控植物的生长发育来提高作物的产量, 改善作物的品质[7]。植物通过抗氧化酶系统来清除新陈代谢过程中以及外界逆境胁迫下产生的活性氧, 对维持其正常生长具有重要的作用。抗氧化酶系统中控制植物体内活性氧积累的最主要的酶有过氧化物酶 (POD) 、过氧化氢酶 (CAT) 和超氧化物歧化酶 (SOD) 3种。其与植物的呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系, 在植物生长发育的过程中, 其活性不断发生变化, 因此测定这3种酶的活性可以反映出某一时期植物体内代谢水平的变化[8]。
 
目前, 关于外源喷MeJA对艾纳香植株内激素和抗氧化酶影响的研究较少。本实验以不同浓度的MeJA作为外源生长调节剂, 外源诱导艾纳香植株不同叶位的叶片, 测定诱导后不同时间段内, 不同叶位叶片中L-龙脑含量以及4种内源激素含量和3种抗氧化酶活性, 以期揭示MeJA对促进L-龙脑积累的机制, 为艾纳香的高产栽培技术提供理论依据。
 
1 材料与仪器
1.1 材料
艾纳香栽培于海南省儋州市中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所南药种质资源圃, 经中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所庞玉新研究员鉴定为艾纳香Blumea balsamifera L.DC., 用于实验的对象为艾纳香长势良好的不同叶位的叶片。
 
1.2 试剂与仪器
L-龙脑对照品 (Alfa Aesar, 质量分数>98.0%) ;醋酸乙酯 (广州友联化学试剂有限公司, 分析纯) ;去离子水、MeJA (Sigma公司, 质量分数>99.9%) 、pH值分别为6.0、7.0、7.8的标准磷酸缓冲液 (东莞市思博电子材料有限公司) ;甲硫氨酸 (上海Macklin生化有限公司) ;愈创木酚、核黄素以及氮蓝四唑均为北京Solarbio生命科学公司产品;H2O2、EDTA-Na2均为国产分析纯试剂。
 
2 方法
2.1 试剂配制与样品处理
2.1.1 试剂配制
根据其他文献中人工生长调节剂在药用植物诱导中所选取的浓度[9,10], MeJA浓度均配制为10.00、1.00、0.10、0.01 mmol/L的溶液, 具体配制方法:由商品包装给出的密度与相对分子质量可以计算出MeJA原液与欲配制浓度的定量关系。分别准确移取MeJA原液1 090.00、109.00、10.90、1.09μL于500 mL量瓶内, 再分别加入2μL聚山梨酯20, 最后用去离子水定容至刻度, 摇匀后即得到浓度分别为10.00、1.00、0.10、0.01 mmol/L的溶液, 装入干净的喷壶中待用, 分别贴上标签。
 
2.1.2样品处理
选择田间生长状况良好的艾纳香单株进行无性繁殖, 获得艾纳香田间表现基本一致的植株, 分为2组, 一组用4个浓度梯度的MeJA溶液进行叶面均匀喷施处理, 做好标记。另一组用去离子水进行叶面喷施作为空白对照。进行3次重复实验, 考察实验结果的相对稳定性与可重复性。根据艾纳香叶片所在叶位和生理状态的不同, 叶片被分为嫩叶 (植株顶端未完全展开, 颜色略显黄白色的叶片) 、成熟叶 (植株中部, 完全长大、颜色深绿的叶片) 、老叶 (植株下方, 叶缘发黄卷曲的叶片) 3种类别, 分别考察不同叶位的叶片中的抗氧化酶活性和内源激素对艾纳香叶片中L-龙脑积累的响应特性。根据课题组前期预试验表明, 对艾纳香外源喷施这2种人工生长调节剂后, 在24~72 h差异表现较为明显, 为此, 本实验选取从处理结束后第24、48、72小时进行采样。
 
2.2 L-龙脑含量测定
由于L-龙脑具有易挥发性, 为了减少采样后L-龙脑的损失以减小实验误差, 每次采集的叶片样本均及时处理。将采集的艾纳香叶片迅即置于研钵中加液氮研磨成粉, 精密称取研磨粉末2 g, 用醋酸乙酯超声提取法进行挥发油提取, 并定容滤过, 备用。样品的检测:主要采用气相色谱法测定L-龙脑含量。色谱条件为HP-5石英毛细管色谱柱 (30m×0.32 mm, 0.25μm) ;以80℃为起始温度, 保持2 min, 然后以5℃/min升温至100℃, 再以20℃/min升温至200℃;进样口温度220℃;FID检测器温度为240℃;进样量0.6μL, 不分流。
 
2.3 酶活力测定
2.3.1 酶的提取
称取艾纳香新鲜叶片0.5 g, 剪碎置于预冷的研钵中, 先加入1 mL pH值为7.8的磷酸缓冲液进行研磨, 待完全磨碎之后再加入4 mL pH值为7.8的磷酸缓冲液匀浆, 之后倒入5mL离心管中以4 000 r/min离心15 min, 上清液即是酶的粗提液。酶液储存于4℃冰箱中。
 
2.3.2 POD活力测定
取100 mL pH值为6.0的磷酸缓冲液, 加入0.5 m L的愈创木酚原液和1 m L30%的H2O2, 混合均匀即得到反应液。取27支试管, 每支试管分装3 m L反应液, 逐个加入50μL的酶液, 在470 nm波长处测定吸光度 (A) 值, 每30秒记录1次, 测2 min。POD酶活力单位计算:以每分钟内A470变化0.01为一个POD活力单位 (UPOD) 。
 
 
ΔA470是反应时间内A470值的变化;V0是酶粗提液的体积;V1是测定时酶的体积;m是新鲜叶片的质量;t是测定总时间;经过算式的合并化简, UPOD=ΔA470×10 000
 
2.3.3 CAT活力测定
测定步骤取200 mL pH为7.0的磷酸缓冲液, 加入310μL 30%的H2O2, 混合均匀即得反应液。取27支试管, 每支试管分装3 mL反应液, 逐个加入50μL的酶液, 在240 nm波长处测定紫外A240值, 每隔5 s记录1次, 共测定30 s。CAT酶活力单位计算:以每分钟A240减少0.01为一个酶活力单位 (UCAT) 。
 
 
ΔA470是反应时间内A值的变化;V0是酶粗提液的体积;V1是测定时酶的体积;m是新鲜叶片的质量;t是测定总时间;经过算式的合并化简, UCAT=ΔA240×4 000
 
2.3.4 SOD活力测定
测定步骤按照表1配制各组反应液。其中对照组不加酶液 (阴暗处理) , 用于调零。对照组 (光照处理) 为最大光化还原组, 然后将各管放在4 000 lx光照培养箱中光照处理20min, 在560 nm波长处测定A560值。SOD酶活力单位计算:以抑制NBT光化还原反应50%作为一个活力单位 (USOD) 。
 
 
Ack是光照对照A值;AE是样品A值;V是酶液总体积;W是新鲜样品质量;Vt是测定对酶液的实际用量;通过对公式合并化简, USOD=400× (Ack-AE) /Ack
 
2.4 内源激素含量测定
参考文献报道方法[11,12,13], 将采集的叶片1.0 g于研钵中, 加入约0.5 g石英砂, 加入2 m L提取液 (80%甲醇, 内含有BHT和PVPP) , 冰浴研磨至粉末状, 全部转入10 mL离心管中, 4℃提取10 h, 4 000 r/min离心15 min, 取上清液放入C18萃取柱滤过, 然后放入真空离心浓缩干燥器浓缩, 加入稀释液定容至1 mL, 备用。
 
表1 SOD测定反应液的配制Table 1 Preparation of reaction solution for SOD determination     下载原表
 
 表1 SOD测定反应液的配制Table 1 Preparation of reaction solution for SOD determination
将上述制备液采用酶联免疫法分别进行生长素 (IAA) 、脱落酸 (ABA) 、赤霉素 (GA3) 和玉米素 (ZT) 含量测定。ELISA试剂盒由北京方程生物技术有限公司提供, 按其说明书进行操作。
 
2.5 数据处理
实验数据分析采用Microsoft Excel 2003和SPSS 20.0统计分析软件。
 
3 结果与分析
3.1 不同浓度的MeJA对艾纳香叶片中L-龙脑含量的影响
由表2可知, 不同浓度的MeJA对L-龙脑积累的影响。总体来看不同浓度的MeJA均能促进艾纳香叶片中L-龙脑的积累。除了10 mmol/L MeJA处理外, 其他浓度处理下艾纳香3个叶位的叶片中L-龙脑积累量随着时间推移呈逐渐上升趋势, 尤其浓度为1 mmol/L的MeJA的处理效果最好, 在72 h时3个叶位的叶片均达到L-龙脑积累的最大值, 分别为3.346、3.043、2.044mg/g, 且与对照有显著差异。由此可见, 1 mmol/L的MeJA处理对艾纳香叶片中L-龙脑的积累有较大影响。
 
3.2 不同浓度的MeJA对艾纳香叶片中内源激素含量的影响
由表3可知, 不同浓度MeJA处理, 对艾纳香不同叶位中IAA、ABA、GA3和ZT积累具有不同程度的影响。当MeJA浓度为0.1 mmol/L时, 艾纳香老叶中IAA含量在24 h达到最高, 显著高于对照组 (P<0.05) 。在成熟叶中, 0.1 mmol/L的MeJA处理下IAA含量在48 h时达最高值, 而其他浓度MeJA均不同程度地抑制了嫩叶中IAA含量, IAA含量随浓度的升高而降低。
 
除10 mmol/L外的其他MeJA浓度处理下, 嫩叶中ABA含量均显著低于对照 (P<0.05) 。10mmol/L MeJA处理嫩叶后24 h, 其ABA含量显著高于对照。浓度为0.01 mmol/L MeJA处理艾纳香成熟叶和老叶后, 其叶片中的ABA含量均在72 h时显著高于对照 (P<0.05) 。浓度为10 mmol/L MeJA处理艾纳香成熟叶后, 其ABA含量在24 h达最大值, 之后迅速减少, 72 h时最低。
 
表2 MeJA处理后艾纳香叶片中L-龙脑的含量Table 2 L-borneol content of B.balsamifera leaves after treatments of MeJA     下载原表
 
 表2 MeJA处理后艾纳香叶片中L-龙脑的含量Table 2 L-borneol content of B.balsamifera leaves after treatments of MeJA
大写字母表示P<0.05水平下显著差异, 下同;老叶在各浓度处理下没有发生显著变化Capital letters in table indicate significant differences at P<0.05 levels, same as below;old leaves did not change significantly under various concentrations
 
表3 MeJA处理后艾纳香叶片中IAA、ABA、GA3和ZT含量Table 3 IAA, ABA, GA3, and ZT content of B.balsamifera leaves after treatments of Me JA     下载原表
 
 表3 MeJA处理后艾纳香叶片中IAA、ABA、GA3和ZT含量Table 3 IAA, ABA, GA3, and ZT content of B.balsamifera leaves after treatments of Me JA
除了0.01 mmol/L外, 其他浓度的MeJA处理艾纳香嫩叶后, GA3含量均低于对照。0.01 mmol/L MeJA处理嫩叶后72 h, 其叶片中GA3达到含量的最大值。在成熟叶中, 不同浓度MeJA对GA3的积累均有不同程度的抑制作用。而0.01 mmol/L MeJA处理老叶后24 h, GA3积累量显著增加 (P<0.05) 。
 
对于叶片中的ZT含量来说, 不同浓度的MeJA对艾纳香不同叶位叶片中ZT含量的积累均有不同程度的促进作用。1 mmol/L MeJA处理促进艾纳香成熟叶在24 h时, ZT含量达到最大值。从表3可见, 不同浓度的MeJA处理对于艾纳香叶片中内源激素积累量的影响不同, 其中以浓度为0.01 mmol/L的MeJA的效果较好。
 
3.3 不同浓度的MeJA对艾纳香叶片中抗氧化酶活性的影响
不同浓度MeJA对艾纳香不同叶位叶中POD、CAT和SOD的活力有显著影响 (表4) 。其中, 10mmol/L的MeJA处理下艾纳香各叶片中POD的活性均显著低于对照组 (P<0.05) , 尤其对老叶中POD的活性影响严重, 酶活力单位最低时达到1 000 U/ (min·g) 以下。0.01 mmol/L和0.10 mmol/L的MeJA诱导的成熟叶和老叶在24 h时POD的活性低于对照;但随着时间的推移, POD活性逐渐升高, 在72 h各叶位叶片中POD活性均显著高于对照组 (P<0.05) ;而嫩叶在这2种浓度诱导下表现为, 在48 h时POD活力最低, 在72 h时酶活力显著高于对照 (P<0.05) 。从总体来看, 1 mmol/L的MeJA有诱导艾纳香叶片POD活性增高的作用, 这种作用在嫩叶中相对较弱, 在成熟叶中最明显, 3个时段的样本中酶活力均高于对照组。在老叶中, 1 mmol/L的MeJA在处理后随着时间的变化, 酶活力呈现先增强后减弱, 然后增强的趋势。
 
对CAT而言, 根据艾纳香叶位的不同, 对不同浓度的Me JA的诱导表现出不同的抑制或促进作用。在成熟叶, 0.01 mmol/L的MeJA诱导后, CAT活力随时间推移而逐渐增强, 到第72小时CAT活力达最高, 显著高于对照组 (P<0.05) , 而这种变化趋势在嫩叶和老叶中不显著。10 mmol/L的MeJA处理艾纳香嫩叶后, 第24、48小时CAT活力被诱导增强, 显著高于对照组的酶活力。其余3个浓度MeJA处理艾纳香嫩叶, CAT的活力均低于对照组。在成熟叶中, 10 mmol/L的MeJA在处理后的第24小时CAT活力有显著增强, 之后逐渐下降, 但总体上仍表现为高于对照组。
 
表4 MeJA处理后艾纳香叶片中POD、CAT和SOD的活性Table 4 POD, CAT, and SOD activies of B.balsamifera leaves after treatments of Me JA     下载原表
 
 表4 MeJA处理后艾纳香叶片中POD、CAT和SOD的活性Table 4 POD, CAT, and SOD activies of B.balsamifera leaves after treatments of Me JA
不同浓度MeJA处理过的艾纳香叶片中SOD活力变化主要表现为1 mmol/L的MeJA在处理之后24 h内, 艾纳香不同叶位叶片中的SOD活性均稍低于对照, 之后第48、72小时, 酶活力逐渐升高, 至第72小时酶活力达最大, 显著高于对照组。其余浓度的MeJA对艾纳香不同叶位叶片中的SOD活力均表现为抑制, 其中嫩叶和成熟叶对10mmol/L MeJA的响应较强烈。0.1 mmol/L的MeJA对老叶中SOD的抑制作用最强。另外, 低浓度的MeJA (≤0.1 mmol/L) 对SOD活性的影响随时间推移而逐渐减弱。
 
4 讨论
次生代谢是植物生命活动过程中产生的, 可以通过一些生物因素和非生物因素的诱导使其大量产生。L-龙脑作为艾纳香主要的萜类次生代谢产物, 也是艾纳香重要的药用活性成分, 提高其含量对于艾纳香的药用价值有着重要的意义。有研究表明, 外源喷施0.1 mmol/L MeJA诱导, 可以使鱼腥草单萜升高, MeJA浓度越高, 反而对鱼腥草单萜的产生有抑制作用, 并且高浓度的MeJA会对植物造成氧化胁迫[9]。另外, 研究还发现, 单萜因其具有活泼的不饱和双键, 有较强的抗氧化能力, 可作为一种抗氧化因子清除由逆境胁迫诱导产生的过量活性氧 (reactive oxygen species, ROS) [14], 本实验通过外源喷施不同浓度的MeJA来观察L-龙脑、内源激素以及抗氧化酶含量的变化, 结果表明1mmol/L的MeJA对于艾纳香叶片中的L-龙脑积累的效果较好。可能是由于随着时间的推移1mmol/L MeJA诱导下艾纳香叶片中SOD含量增加, 在SOD的作用超氧负离子转化为一种常见的活性氧分子H2O2, 再由CAT和POD消除[15], 但是随着时间的推移, 1 mmol/L MeJA诱导下艾纳香叶片中CAT和POD虽然有所增加但不太明显, ROS产生与清除的动态平衡遭到破坏, 总体表现出抗氧化酶消除活性氧的能力降低, 促进了ROS以H2O2形式积累, 因此, 艾纳香植株体通过促进L-龙脑等萜类物质的大量积累来降低这种氧化胁迫造成的伤害。
 
本研究中, 低浓度的MeJA (≤0.1 mmol/L) 可以促进于艾纳香叶片中的IAA、GA3和ZT的积累, 而高浓度的MeJA (≥10 mmol/L) 对于ABA的积累有效果。对于植物来说IAA可以推迟叶片衰老, 促进叶片扩大, GA3可以抑制成熟和器官衰老, 延缓叶片衰老, ZT作为一种天然的游离态细胞分裂素广泛存在于植物体内, 具有促进细胞分裂, 延缓植物衰老的作用, 而ABA主要合成于处在休眠状态和将要脱落的器官中, 主要作用抑制植株生长, 另外, ABA可以增强植物的抗逆性[7]。低浓度的MeJA (≤0.1 mmol/L) 可使艾纳香体内的激素含量发生显著的变化, 进而调控艾纳香植株的生长。高浓度的MeJA (≥10 mmol/L) 一方面增加了ABA含量, 促进了艾纳香植株的衰老, 另一方面对艾纳香植株产生胁迫, 产生大量的ABA来减少对植株的胁迫伤害。

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文章名称:茉莉酸甲酯对艾纳香活性成分、抗氧化酶活力以及内源激素含量的影响

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