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四川盆周山地重楼属植物药用资源的筛选及评价

分类:(三) 发表时间:2019-08-20

重楼为百合科 (Liliaceae) 重楼属Paris L.植物统称, 具有抗肿瘤、抑菌消炎、镇静、止血等作用[1], 已成为多种中成药和新药的主要原材料。然而, 重楼的个体发育过程十分缓慢[2], 加之野生
重楼为百合科 (Liliaceae) 重楼属Paris L.植物统称, 具有抗肿瘤、抑菌消炎、镇静、止血等作用[1], 已成为多种中成药和新药的主要原材料。然而, 重楼的个体发育过程十分缓慢[2], 加之野生资源的过度开采, 已造成重楼市场长期供不应求。因此, 挖掘具有药用价值的优异重楼资源, 是解决重楼产能低下, 保障重楼可持续利用的重要途径。
 
目前, 全世界已发现26种重楼属植物, 主要分布在欧亚大陆的热带与温带地区, 我国多达19种, 以西南地区最多, 其中四川分布13种[3]。重楼具有丰富的遗传多样性, 大到不同种, 小到同种的居群间普遍都存在差异, 且差异程度各不相同, 造成了复杂的表型多样性[4]。所以, 单从形态学上较难准确地对其分类。植物分子系统学结合DNA条形码技术, 为探讨植物分类及类群之间的系统发育关系提供了新的方法[5]。Ji等[6]利用ITS、psbA-trnH等DNA序列对重楼属植物的分子进化进行了研究, 成功揭示了重楼属植物的种间关系。
 
正品重楼, 按《中国药典》2015年版规定仅为滇重楼P.polyphylla Smith.var.yunnanensis (Fanch.) Hand.-Mazz和华重楼P.polyphylla Smith.var.chinensis (Franch.) Hara[7]。然而, 巨大的市场需求量已造成上述2种重楼资源被大量采挖, 资源极度匮乏, 因此实际上几乎所有重楼属植物均已做药用[3,8]。甾体皂苷类化合物是重楼的主要活性成分, 占总化合物的70%以上[9]。《中国药典》2015年版以薯蓣皂苷类重楼皂苷I、II, 偏诺类重楼皂苷VI、VII的含量判断其药用潜力[7]。但受遗传多样性影响, 不仅不同重楼属植物的药效成分含量及其比例具有一定差异[10], 同一个种来自不同产地、不同居群的重楼, 其药效品质也各具特性[11]。故挖掘特定产地的重楼属植物资源, 分析其相应的药用潜力, 充分发挥其药效价值, 保障“各尽其用、对症下药”, 对扩增重楼属药用材料, 缓解药用资源压力有重要意义。
 
四川作为重楼属植物的重要分布中心和遗传多样化中心之一, 也是重楼药材的道地产区之一, 储备了多种具有药用潜力的重楼属资源。本研究收集并筛选四川盆地周边山地不同居群的野生重楼资源, 基于DNA条形码分子鉴定技术和HPLC分析技术, 进行系统发育分析和药效活性成分检测, 筛选具有药用潜力的优异地方资源, 以期为重楼的可持续利用提供基础。
 
1 材料、仪器与试剂
1.1 材料
样品分别采自四川省眉山市洪雅县、绵阳市北川县、甘孜州康定县及广元市青川县等地。挖取新鲜活体植株, 根据不同居群划分为21份资源 (表1) , 每份资源含1~21株材料, 共177株, 引种至成都双流和什邡种植基地进行种植。重楼对照药材 (CK) 购自北京索莱宝科技有限公司, 为成品滇重楼。
 
1.2 仪器与试剂
Agilent 1260高效液相色谱仪 (G1311B四元泵、G1322B脱气机、G1329B自动进样器、Chemstation色谱工作站、G1315D可变波长检测器) ;Libro AEL-40SM十万分之一电子分析天平 (岛津公司, 日本) ;超声波清洗器 (南京科尔仪器设备有限公司) ;低温高速离心机 (赛默飞有限公司, 美国) ;Tissue Lyser II高通量组织研磨仪 (QIAGEN公司, 德国) ;氮吹仪 (杭州奥盛仪器有限公司) ;凝胶成像分析仪 (上海培清科技有限公司) 。重楼皂苷I对照品 (批号111590-201103) 、重楼皂苷II对照品 (批号111591-201103) 、重楼皂苷VI对照品 (批号111592-201203) 、重楼皂苷VII对照品 (批号111593-200402) 购自中国食品药品检定研究院, 质量分数大于98%;甲醇 (色谱纯) 、乙腈 (色谱纯) 购自上海科醚化学科技有限公司。
 
表1 重楼属样品信息Table 1 Information of plant samples from Paris genus     下载原表
 
 表1 重楼属样品信息Table 1 Information of plant samples from Paris genus
2 方法与结果
2.1 样品筛选
引种至成都平原后, 对表1中所收集的21份资源的植株表型及生长势进行初步观察, 筛选出居群编号1、7、17引种至基地后长势较好的3种资源分别代号为GQ、MH和GK, 其中GQ和MH块茎较大, 而GK表现为多芽块茎, 具体表型见表2。经中国科学院昆明植物研究所纪运恒副研究员初步鉴定为华重楼P.polyphylla Smith.var.chinensis (Franch.) Hara (GQ) 、滇重楼P.polyphylla Smith.var.yunnanensis (Fanch.) Hand.-Mazz. (GK) 、长柱重楼P.forrestii (Takht.) H.Li (MH) 。
 
2.2 序列扩增
取新鲜重楼叶片, 利用改良CTAB法提取总DNA。参考之前研究[6,12], 设计合成多对引物进行初步扩增筛选, 最终确定的ITS序列扩增引物为5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’、5’-TC-CTCCTCCGCTT ATTGATATGC-3’;psbA-trnH序列扩增引物为5’-GTTATGCATGAACGTAATG-CTC-3’、5’-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3’。PCR反应总体系为25μL, 其中10×PCR Buffer 2.0μL, 2.5 mmol/L dNTPs 2.0μL, 25 mmol/L MgSO41.0μL, 上下游引物各0.5μL (10μmol/L) , KOD-Plus-聚合酶0.5μL (1 U/μL) , 模板DNA 1.0μL, ddH2O补足25μL。PCR程序为94℃预变性5 min, 94℃变性30 s, 退火30 s, 72℃延伸45 s, 30次循环, 最后72℃延伸7 min。PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶中电泳20 min, 切胶回收, 回收产物连接到pEASY-Blunt Cloning Kit载体, 转化Trans1-T1感受态细胞, 检测阳性克隆, 测序。引物合成及测序服务均由成都擎科梓熙生物技术有限公司完成。测序结果显示, GQ、GK和MH的ITS区扩增片断长度为634 bp (图1-A) , psb A-trn H区扩增片断长度为1 077 bp (图1-B) 。
 
表2 GQ、GK和MH表型信息Table 2 Phenotype of GQ, GK, and MH     下载原表
 
 表2 GQ、GK和MH表型信息Table 2 Phenotype of GQ, GK, and MH
 图1 GQ、GK、MH的ITS (A) 序列和psb A-trn H (B) 序列Fig.1 ITS (A) and psb A-trn H (B) sequences of GQ, GK, and MH
图1 GQ、GK、MH的ITS (A) 序列和psb A-trn H (B) 序列Fig.1 ITS (A) and psb A-trn H (B) sequences of GQ, GK, and MH   下载原图
 
 图1 GQ、GK、MH的ITS (A) 序列和psb A-trn H (B) 序列Fig.1 ITS (A) and psb A-trn H (B) sequences of GQ, GK, and MH
图1 GQ、GK、MH的ITS (A) 序列和psb A-trn H (B) 序列Fig.1 ITS (A) and psb A-trn H (B) sequences of GQ, GK, and MH   下载原图
 
2.3系统聚类树的构建
在NCBI中查询并下载已注册的重楼属植物的ITS、psbA-trnH相关序列 (表3) , 用MEGA 6.0将其与候选资源的序列进行比对, 去除头尾不完整的部分, 排好的序列以延龄草科[Trillium grandiflorum (Michx.) Salisb、Trillium luteum (Muhl.)
 
Harb和Trillium rivale (S.Watson) S.B.Farmer]为外类群, 进行系统发育树构建, 采用最大似然法, bootstrap法自检验1 000次, 获得系统聚类树。
 
将GQ、GK和MH 3种资源与26种已知重楼的ITS和psb A-trn H序列 (表3) 进行比较, 根据序列比对结果构建系统聚类树 (图2) , 其中: (1) GQ:ITS序列仅与华重楼在第215个位点存在单碱基差异, 序列一致性为99.84%;psb A-trn H序列与华重楼有8个位点的差异, 序列一致性为99.26%, 2个聚类树结果都显示GQ与华重楼聚在同一支。 (2) GK:ITS序列与滇重楼存在33个位点差异, 序列一致性为94.79%;而psb A-trn H序列与滇重楼只有6个位点的差异, 序列一致性高达99.44%, psb A-trn H序列聚类树结果与滇重楼所属的蚤休组 (sect.Euthyra) 分在一个支。 (3) MH:ITS序列151位点上为碱基C而其余重楼均为T, 与长柱重楼存在36个位点差异, 序列一致性为94.32%, 聚类结果单独分为一支;psb A-trn H序列与长柱重楼有8个位点的差异, 序列一致性为99.26%, 聚类树结果显示与长柱重楼所在支聚在一起。
 
表3 重楼属植物序列登陆号Table 3 GeneBank accession numbers of ITS and psbA-trnH     下载原表
 
 表3 重楼属植物序列登陆号Table 3 GeneBank accession numbers of ITS and psbA-trnH
2.4 皂苷类成分的测定
2.4.1 对照品溶液的制备
取重楼皂苷I、II、VI、VII对照品各10 mg, 精密称定, 加甲醇制成混合对照品溶液10 mL。
 
2.4.2 供试品溶液的制备
挖取正常倒苗后的块茎, 洗净、切片、晾干、磨粉、烘干, 精密称取各重楼药材粉末0.5 g, 精密加入90%甲醇25 mL, 加热回流1 h, 0.45μm微孔滤膜滤过, 氮吹仪吹干, 加入90%甲醇使溶解并定容至10 m L, 得到供试品溶液, 低温保存待测[7]。
 
2.4.3 色谱条件
Agilent ZORBAX SB-C18 (250mm×4.6 mm, 5μm) 色谱柱, 流动相为乙腈 (A) -水 (B) , 梯度洗脱 (0~40 min, 30.0%~60.0%A;40~50 min, 60.0%~30.0%A) ;检测波长203 nm, 体积流量1.0 mL/min, 柱温30℃。色谱峰理论塔板数按重楼皂苷I峰计算不低于4 000。对照品和样品的色谱图见图3。由图3可知, 在设定的色谱条件下, 对照品和供试品溶液的HPLC各个化合物分离良好, 色谱峰的分离度均>1.5。重楼皂苷I、II、VI、VII的保留时间为31.763、28.906、21.785、19.178 min。
 
 图2 基于ITS (A) 和psb A-trn H (B) 的系统聚类树Fig.2 Phylogenetic trees based on sequences of ITS (A) and psb A-trn H (B)
图2 基于ITS (A) 和psb A-trn H (B) 的系统聚类树Fig.2 Phylogenetic trees based on sequences of ITS (A) and psb A-trn H (B)   下载原图
 
不同的色块代表不同的分支, 外圈虚线代表李恒在1998年对重楼属植物的系统分类, P-北重楼组A-五指莲组D-海南组E-蚤休组F-球药隔组K-日本重楼组M-花叶组T-黑籽组Different color blocks represent different branches, dotted line represents packet of Li (1998) P-sect.Paris A-sect.Axiparis D-sect.Dunnianae E-sect.Euthyra F-sect.Fargesianae K-sect.Kinugasa M-sect.Marmoratae T-sect.Thibeticae
 
 图3 GQ (A) 、GK (B) 、MH (C) 、CK (D) 和皂苷对照品 (E) 的HPLC图谱Fig.3 Typical HPLC of GQ (A) , GK (B) , MH (C) , P.polyphylla var.yunnanensis (D) , and saponin standard (E)
图3 GQ (A) 、GK (B) 、MH (C) 、CK (D) 和皂苷对照品 (E) 的HPLC图谱Fig.3 Typical HPLC of GQ (A) , GK (B) , MH (C) , P.polyphylla var.yunnanensis (D) , and saponin standard (E)   下载原图
 
2.4.4 标准曲线的绘制
将“2.4.1”项对照品混合溶液稀释成0.005、0.010、0.020、0.050、0.100μg/μL。分别进样10μL, 不同的进样量为横坐标 (X) , 峰面积为纵坐标 (Y) , 进行线性回归。得到重楼皂苷I、II、VI、VII的回归方程分别为Y重楼皂苷I=2.525 2 X+0.263 6, r=1.000;Y重楼皂苷II=2.129 9 X-0.832 0, r=0.999 9;Y重楼皂苷VI=2.974 5 X-1.000 3, r=0.999 9;Y重楼皂苷VII=2.129 7 X+1.034 8, r=0.999 9。各项系统适应性考察、测定法均参照《中国药典》2015年版的含量测定相关操作进行, 每个样品3个重复, 每重复平行测定3次, 取均值, RSD均小于0.3%[6,10,13]。
 
2.4.5 样品的测定
取“2.4.2”项供试品溶液, 按“2.4.3”项色谱条件测定, 根据标准曲线方程计算各成分含量。由皂苷含量结果可知 (图4、表4) , 重复间稳定性较好, 但不同资源所含皂苷的类型、含量及其所占比例差异较大。其中:对照药材滇重楼 (CK) 仅测出重楼皂苷I、II和VII, 总含量为6.15 mg/g, 重楼皂苷VII占比最高 (62.76%) ;GQ检测出含4种待测皂苷类型, 与CK、GK和MH相比4种皂苷总含量最高 (10.57 mg/g) , 且其中重楼皂苷I占4种皂苷总量的比例最高 (74.93%) ;GK未检测到重楼皂苷II且总含量最低 (2.98 mg/g) , 但其重楼皂苷VII占比为56.38%, 为4种所测样本中重楼皂苷VII的最高占比;MH同CK一样无重楼皂苷VI, 但皂苷总含量较高 (10.14 mg/g) , 且各皂苷所占比例与CK相比也有较大差异, 其中重楼皂苷I占比最高 (80.57%) , 比CK高出73.25%, 而重楼皂苷VII占比较低, 仅为1.18%。
 
 图4 资源热图Fig.4 Thermal map of three resources
图4 资源热图Fig.4 Thermal map of three resources   下载原图
 
表4 3个资源重楼皂苷I、II、VI、VII的含量 (n=3) Table 4 Content of saponins I, II, VI, and VII of three resources (n=3)     下载原表
 
 表4 3个资源重楼皂苷I、II、VI、VII的含量 (n=3) Table 4 Content of saponins I, II, VI, and VII of three resources (n=3)
“*”表示超过药典规定的含量要求“—”表示未检测出“*”means that content of Paris saponins I, II, VI and VII is more than 6 mg·g-1“—”means that content of Paris saponins I, II, VI, and VII is not detected
 
3 讨论
重楼作为一种用药量极大的中药, 其产量受限于缓慢的发育过程, 质量又受遗传多样性影响, 造成重楼市场品种混乱, 品质参差不齐。优异的种质资源是培育高产、优质、广适品种的重要材料基础, 有利于保障药效均一性, 解决重楼市场产能低下等问题。因此近年来, 重楼属种质资源的评价研究已受到逐渐重视[14]。在本研究中, 基于四川盆周山地高海拔生长环境内储备的野生重楼资源库, 收集了21个居群的重楼属资源材料, 并引种至成都平原, 根据引种成功率、长势及表型, 筛选了编号为GQ、GK、MH的3个表现优异的资源, 其中GQ资源块茎大, 植株健壮, 在成都平原适应性强, 长势好;GK资源表现为多芽块茎, 但春天出苗时间晚, 长势好;MH资源块茎较大, 植株外型与其他材料差异较大, 矮壮, 倒苗时间晚, 长势好。经专家形态学鉴定, GQ、GK、MH分别为华重楼、滇重楼、长柱重楼。
 
由于重楼属下的种较多, 种下又有不同的变种和变型。不同种、产地及居群的重楼属植物, 经长期的自然选择, 其表型及药效成分等性状均具差异[4,11,15,16], 而这些差异性状往往是受多样化的遗传基础控制的。本研究中, GQ、GK植株的枝干、叶片等表型分别和重楼属的华重楼、滇重楼相近, 但在花特征方面, GQ和华重楼、GK和滇重楼却有明显差异 (表3) 。据李恒的记载, 华重楼花瓣多呈狭线形, 滇重楼花瓣上部扩宽呈狭匙形[2], 而本研究中华重楼GQ的花瓣呈狭匙形, 滇重楼GK花瓣为狭线形。因此, 本实验进一步结合DNA条形码技术, 通过分子鉴定对3个资源的“物种”分类关系进行验证。分子鉴定的结果表明:根据ITS序列, GQ与华重楼的亲缘关系十分紧密;GK与侧膜亚属聚在一亚支上, 与滇重楼亲缘关系较近;但MH却被单独为一支, 与其亲缘关系最近的支为中轴亚属亚支, 说明MH与包括长柱重楼在内的中轴亚属在进化上应有着很近的亲缘关系。由于ITS的序列短, 能够提供性状数量有限, 且ITS在同种的个体间也存在变异, 承受的选择压力小, 因此, 发生突变的概率大大增加, 其片段的插入、缺失和替换是常见的, 这些有利于获得变异信息来分析物种的遗传多样性, 但同时也不可避免地增大了分析的误差[17]。任保青等[18]认为单用1个基因或1个短的DNA片段来区别物种几乎是不可能的, 但是可以通过多个条形码组合来进行物种的鉴定。国家药典委员会于2012年讨论并通过在《中国药典》2010年版增补本中列入《中药材DNA条形码分子鉴定指导原则》, 该指导原则通过对大样本量中药材进行DNA条形码分子鉴定研究, 建立以ITS2序列为核心、psbA-trnH序列为辅的植物类药材DNA条形码鉴定体系[19]。而刘涛等[12]的研究结果表明psbA-trnH片段在重楼属的种间变异幅度较大, 可以轻易地将不同种重楼区分开来。因此课题组进一步利用psbA-trnH序列进行分子鉴定, 结果表明GQ、GK与华重楼、滇重楼的psbA-trnH序列一致性分别达到99.17%、99.35%, 亲缘关系较近, 聚类后都被分在了侧膜亚属;MH则和中轴亚属组下的长柱重楼的序列相似性达到99.26%, 聚类后与中轴亚属的长柱重楼P.forrestii、皱叶重楼P.rugosa、独龙重楼P.dulongensis分在一支。因此, 综合形态学和分子系统学鉴定结果, 推测GQ、GK、MH分别为华重楼、滇重楼、长柱重楼在四川盆周山地的居群水平上的优良资源材料。
 
由于重楼属同种植物在不同产地的药效活性成分上具有较大差异, 在药效药理上的作用可能也具有偏向性, 直接影响了其药用价值[20]。因此, 挖掘并评价不同种源的重楼种质资源的药效活性成分, 是发挥药用重楼资源最大效用的前提。本研究中, GQ、GK、MH作为不同居群水平上华重楼、滇重楼、长柱重楼资源材料, 和对照CK在皂苷含量方面也各具特点, 其中:华重楼GQ资源是唯一检测出同时含4种皂苷的材料, 总量 (10.57 mg/g) 最高, 显著高于《中国药典》里规定的“不低于6mg/g”, 且重楼皂苷I、II两者的总占比也较高, 表现为92.81%, 推测其为华重楼在四川盆周山地的高药用价值资源材料。和GQ类似, 长柱重楼MH资源的重楼皂苷总量 (10.14 mg/g) 显著高于CK, 重楼皂苷I和II占比也较高, 分别高达80.57%和18.24%, 两者共占98.81%, 这与李朋等[21]的研究结果一致, 即在长柱重楼中主要含有重楼皂苷I和II较多, 含很少或几乎不含偏诺皂苷VI、VII。已有研究表明, 重楼皂苷I、II具有细胞毒活性和免疫调节活性[22], 可能具有抗肝癌、肺癌功效[23,24]。因此GQ和MH可作为重楼皂苷I、II的专用萃取材料, 在肿瘤治疗方面具较大应用潜力, 同时, 也暗示长柱重楼资源MH可能可作为华重楼的替代药材入药。滇重楼GK资源材料的4种皂苷总含量虽最低 (2.98 mg/g) , 但其重楼皂苷VII的占比却最多 (56.38%) , 和滇重楼CK的重楼皂苷VII占比表现一致 (62.76%) , 而研究表明重楼皂苷VII在止血治疗胃炎胃痛等方面效果显著[25,26]。另外, 根据前人研究[27], 重楼皂苷VI具有抑制结肠癌细胞转移作用, 而作为市面上所用最多的入药材料, 许多滇重楼中重楼皂苷VI的含量却较低, 刘欢等[28]对18批不同产地滇重楼的皂苷含量测定结果显示, 其中重楼皂苷VI质量分数仅为0~0.677 mg/g, 在所测总皂苷含量中的占比最高也仅为9.27%, 此结果与本研究对照滇重楼CK结果一致, 即CK中未检测出重楼皂苷VI (表4) 。但本研究滇重楼资源GK中, 重楼皂苷VI却含1.03 mg/g, 占比也较高 (34.56%) , 暗示其在萃取重楼皂苷VI方面具有较大应用价值。
 
综上所述, 基于华重楼资源GQ、滇重楼资源GK和长柱重楼资源MH在成都平原引种后, 生活力和块茎性状等方面的优异表现, 结合其各自的活性成分特点, 认为以上3种资源可作为优良种质资源, 用于重楼育种和药用资源的进一步开发, 为药材合理使用, 提高资源利用率, 解缓资源压力及促进重楼的可持续利用提供材料基础。

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