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不同产地忽地笑的叶绿体基因psb A-trn H序列分析

分类:(三) 发表时间:2019-08-20

忽地笑Lycoris aurea (LHer.) Herb.又称黄花石蒜、铁色箭等, 为石蒜属多年生草本植物, 是一种传统的中药材[1]。其鳞茎内富含石蒜碱 (lycorine) 、加兰他敏 (galanthamine) 、力克拉敏 (lycoramine) 等多
忽地笑Lycoris aurea (L’Her.) Herb.又称黄花石蒜、铁色箭等, 为石蒜属多年生草本植物, 是一种传统的中药材[1]。其鳞茎内富含石蒜碱 (lycorine) 、加兰他敏 (galanthamine) 、力克拉敏 (lycoramine) 等多种生物碱, 可用于治疗小儿麻痹后遗症、老年性痴呆症、重症肌无力等疾病, 并且对癌症具有一定疗效, 具有重要的药用价值[2]。此外, 忽地笑是一种良好的地被植物, 其鳞茎还富含淀粉、雪花莲凝集素等成分, 在园林、工业、农业等领域有广泛应用价值[3,4]。忽地笑适应性强, 生长范围广, 是我国石蒜属植物分布最广的物种, 多样性丰富是其他任何国家和地区所不及的[5], 主要分布在湖南、湖北、广西、贵州、四川、云南、安徽、江苏等16个省市[6,7]。近年来, 由于生态环境的破坏及人为地过度采挖, 致使忽地笑野生资源日益短缺[8]。因此, 收集、保存及整理我国不同产地忽地笑种质资源, 对该资源遗传多样性保护与利用具有重要的理论和实践参考价值。
 
由于忽地笑等石蒜属植物具有先花后叶以及花叶不相见的特殊生长发育特性, 并且该属植物在自然界或人工培育下存在广泛的天然杂交, 变异类型较多, 从形态学鉴别该属植物难度较大[5,9]。近年来, 虽然采用ISSR、RAPD、AFLP等分子标记以及ITS、trn L-F、psb A-trn H等序列片段研究石蒜属种间关系或分子鉴定等报道较多[10,11,12,13,14,15], 但系统地研究忽地笑种质资源的遗传多样性及其演化关系尚未见报道。叶绿体基因psb A-trn H片段是进化速率最快的叶绿体间隔区片段之一, 可提供较为丰富的变异位点和信息位点[16];近些年来, 叶绿体DNA在植物遗传结构评价和居群遗传多样性研究等领域得到广泛应用[17]。本实验采用叶绿体基因psb A-trn H序列探讨不同产地忽地笑居群的遗传变异程度及其进化关系, 为忽地笑种质资源鉴别、遗传多样性保护和遗传育种提供重要的分子依据。
 
1材料与方法
1.1材料
2014—2016年在忽地笑开花期 (8月) 进行采样, 从湖南、湖北、四川、贵州、广西等15个省 (市) 共采集52个忽地笑居群材料, 每2个居群之间至少相隔50 km以上;每个居群采集10~20个样品, 植株间距20 m以上, 样品分布覆盖我国忽地笑的主要产区, 实验材料基本信息见表1。实验时, 每个居群随机选取3个植株, 52个不同产地忽地笑居群共156个样本数;采取忽地笑新鲜叶片, 放在保鲜袋中, 用硅胶干燥, 带回实验室后置于-70℃冰箱中保存备用。
 
表1 忽地笑居群的基本信息Table 1 Basic information of L.aurea populations     下载原表
 
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 表1 忽地笑居群的基本信息Table 1 Basic information of L.aurea populations
1.2方法
1.2.1样品DNA的提取与扩增
采用改良的CTAB法与PCR产物纯化试剂盒相结合来提取忽地笑样品DNA。psb A-trn H区扩增使用引物5’-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3’和5’-CGC-GCATGGTGGATTCACAATCC-3’。其PCR扩增反应体系为50μL。扩增程序:94℃预变性4 min, 94℃变性45 s, 54℃退火45 s, 72℃延伸1 min, 35个循环, 最后72℃延伸10 min[14]。
 
1.2.2叶绿体基因psb A-trn H序列测定
叶绿体基因psb A-trn H序列的PCR扩增产物经1.5%琼脂糖电泳检测, 确定达到测序要求后, 再委托上海生工生物技术服务有限公司进行双向测序。
 
1.2.3数据处理
对测序结果用ClustalX 2软件进行校对拼接, 再采用Mega 5.0软件对序列长度、变异位点、信息位点以及GC含量等序列特征进行分析;采用Mega 5.0软件中的Kimura-2-parameter (K2P) 模型和最大简约法 (maximum parsimony, MP) 分别构建遗传距离矩阵和系统发育树;并且采用DnaSP 5.10计算群体的单倍型数量 (number of haplotypes, H) 、单倍型多样性 (haplotype diversity, Hd) 、核苷酸多样性 (nucleotide diversity, π) 、单倍型多样性方差 (variance of haplotype diversity, Vh) 、单倍型多样性标准差 (standard deviation of haplotype diversity, Sh) 和Tajima’s D值等[18]。
 
2结果与分析
2.1不同产地忽地笑居群叶绿体基因psb A-trn H序列差异分析
通过对我国52个不同产地忽地笑居群的叶绿体基因psb A-trn H序列进行测序, 进行比对后发现序列长度变化范围为544~656 bp, 核苷酸构成富含AT碱基, 其含量为63.0%~64.2%, GC含量为35.8%~37.0%, 远低于AT含量;当空位 (gap) 作为缺失处理时, 52个居群序列检测到变异 (多态性) 位点数共33个, 其中简约信息位点9个, 单一突变位点18个, 插入/缺失片段6个 (表2) , 分别占序列总数的1.35%、2.70%和0.90%。由表2可知, 9个简约信息位点分别出现在第17、41、54、58、136、189、499、650、651位点;在第138~228位点之间出现多个碱基缺失/插入或突变, 该序列的6个插入/缺失片段均出现该片段区域, 分别在第138~140、141~145、157~159、161~188、190~226、227~228位点;同一区域 (省市) 或地理分布较近的居群样品之间序列变化相同或相近, 如12个湖南居群中除湖南城步 (HNCB) 在第227~228位点插入CT 2个碱基外, 其余11个居群均缺乏第138~228 bp位点之间91 bp碱基片段, 并且分布在周边的贵州、湖北等省份也表现出相似的序列特点等。
 
表2 忽地笑居群的psb A-trn H序列特征Table 2 Characteristics of psb A-trn H sequences of L.aurea populations     下载原表
 
 表2 忽地笑居群的psb A-trn H序列特征Table 2 Characteristics of psb A-trn H sequences of L.aurea populations
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 表2 忽地笑居群的psb A-trn H序列特征Table 2 Characteristics of psb A-trn H sequences of L.aurea populations
“·”代表与湖南洪江序列位点相同;“-”代表碱基缺失;“+”代表TCCCCCG;“※”代表GGTTATC;“∴”代表TGAATGATAAGTATCTTTTTTTTGATTC;“∷”代表AAATTAACGACGAGATTTATTATCGTTTCTCGCATGT“·”:The base is same with site of Hongjiang population in Hunan;“-”:absence;“+”:TCCCCCG;“※”:GGTTATC;“∴”:TGAATGATAAGTATCTTTTTTTTGATTC;“∷”:AAATTAACGACGAGATTTATTATCGTTTCTCGCATGT
 
2.2不同产地忽地笑居群间遗传距离分析
采用Mega 5.0软件中的K2P模型计算我国不同产地忽地笑居群psb A-trn H序列的遗传距离并构建序列距离矩阵 (表3) 。由表3可知, 供试的52个忽地笑居群间的遗传距离变化范围为0~0.009 47, 平均遗传距离为0.002 63。在同一区域 (仅1个居群的省份除外) 内各居群相比, 云南、广西、江苏、河南和陕西共5个省份居群的遗传距离最小, 均为0;四川居群次之, 其遗传距离为0~0.001 88;湖南除资兴与张家界居群遗传距离为0.003 77外, 其他10个居群之间遗传距离为0~0.001 88;湖北居群之间遗传距离最大, 为0~0.005 65。在不同区域 (省市) 间各居群相比, 广东清远与其他居群的遗传距离均较大, 为0.003 77~0.009 47;其他居群间的遗传距离较小, 为0~0.007 56。可见, 分布在同一区域 (省市) 或地理分布较近的忽地笑种质资源之间遗传距离较小, 相反, 其遗传距离较大。
 
表3 52个忽地笑居群遗传距离Table 3 Genetic distances among 52 populations of L.aurea     下载原表
 
 表3 52个忽地笑居群遗传距离Table 3 Genetic distances among 52 populations of L.aurea
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 表3 52个忽地笑居群遗传距离Table 3 Genetic distances among 52 populations of L.aurea
2.3倍型多态性分析和中性检验
在DNA序列研究中, 一般采用H、Hd和π等来衡量群体的遗传多样性。本研究对psb A-trn H序列进行单倍型多样性分析, 结果表明, 52个忽地笑居群的序列共产生H 10个, Hd值0.749, Vh值0.002 21、Sh值0.047, π值0.002 63, 居群遗传分化系数 (Gst) 0.604 07, 基因流 (Nm) 0.16。可见, 供试的忽地笑群体具有较高的遗传多样性。中性检验表明, psb A-trn H序列的Tajima’s D值、Fu and Li’s D*值、Fu and Li’s F*值检验均为负值, 在P>0.10水平上均不显著, 都未达到显著水平, 符合中性进化模式, 表明从物种水平上忽地笑的psb A-trn H序列进化模式符合中性进化的假设。
 
2.4基于psb A-trn H序列忽地笑种质资源的聚类分析
依据遗传距离和序列差异, 采用MP法对我国52个居群忽地笑种质资源进行聚类分析, 并且构建系统发育树 (图1) 。由图1可知, 我国忽地笑种质资源可聚为4类, 即第1分支包括广东清远 (GDQY) 、福建惠安 (FJHA) 和浙江湖州 (ZJHZ) 共3个居群聚为一类, 主要分布在华南或东南部;第2分支包括江苏镇江 (JSZJ) 、江苏南京 (JSNJ) 、江苏常州 (JSCZ) 和安徽芜湖 (AHWH) 共4个居群聚为一类, 主要分布在华东地区;第3分支包括广西河池 (GXHC) 、桂林 (GXGL) 、百色 (GXBS) , 云南玉溪 (YNYX) 、晋宁 (YNJN) 、昆明 (YNKM) 、蒙自 (YNMZ) , 四川乐山 (SCLS) 、广元 (SCGY) 、雅安 (SCYA) 、宣汉 (SCXH) 、都江堰 (SCDJY) , 重庆丰都 (CQFD) 、城口 (CQCK) 、开县 (CQKX) , 陕西南部的西安户县 (SXXA) 、宝鸡 (SXBJ) , 湖北西北部的十堰 (HBSY) 以及贵州西部的安顺 (GZAS) 共19个居群聚为一类, 主要分布在我国西南部地区;第四分支包括湖南洪江 (HNHJ) 、怀化 (HNHH) 、吉首 (HNJS) 、邵阳 (HNSY) 等12个居群, 湖北荆门 (HBJM) 、恩施 (HBES) 、巴东 (HBBD) , 贵州贵阳 (GZGY) 、铜仁 (GZTR) 、丹寨 (GZDZ) 等6个居群, 河南南部的信阳 (HNXY) 、南阳 (HNNY) 、罗山 (HNLS) , 重庆东南部的武隆 (CQWL) 以及江西南部的赣州 (JXGZ) 共26个居群聚为一类, 主要分布在华中地区。
 
 图1 基于psb A-trn H序列构建忽地笑种质资源的系统发育树Fig.1 Maximum parsimony phylogenetic tree of germplasm resources of L.aurea based on psb A-trn H sequence
图1 基于psb A-trn H序列构建忽地笑种质资源的系统发育树Fig.1 Maximum parsimony phylogenetic tree of germplasm resources of L.aurea based on psb A-trn H sequence   下载原图
 
3讨论
植物的遗传多样性受其生活史特性、繁育方式、种子或花粉的传播能力、地理分布、居群生境、物种的进化地位等很多因素的影响。统计分析表明, 长寿命、广域分布、远交、动物取食传播的物种具有较高的遗传多样性[19]。本研究收集的15省市52个不同产地忽地笑居群材料, 几乎覆盖了忽地笑在我国自然分布的所有区域和生态环境, 包含华东、华南、华西、华中及西南等地区, 经度为102°44′~114°20′, 纬度为23°54′~34°05′, 海拔高度21~1 915 m。在测定的52个叶绿体基因psb A-trn H序列中, 序列长度变化范围为544~656bp, 核苷酸变异多态性位点数共33个, 其中简约信息位点9个, 单一突变位点18个, 插入/缺失片段6个;该序列共产生H 10个, Hd值0.749, Vh值0.002 63, Gst值0.604 07, Nm值0.16。其中, 在第15 bp位点, 贵州安顺居群发生T/C转换单一突变;在第138~226 bp位点, 分布在湖南、湖北 (十堰除外) 、贵州 (安顺除外) 、河南南部等华中地区的忽地笑居群大部分均缺失这89 bp碱基片段;在第41 bp位点, 江苏和安徽居群与其他的相比, 发生A/T颠换;在第499 bp位点, 广东清远、福建惠安和浙江湖州居群与其他的相比, 也发生A/T颠换;在第150~156 bp位点, 除四川乐山为GGTTATC 7个碱基特殊情况外, 供试的其他样品为TCCCCCG7个碱基插入或缺失等。这些结果表明, 我国忽地笑种质资源的遗传变异较大, 遗传多样性较丰富, 但在同一区域或地理分布较近的居群间序列相近或相同, 该序列存在明显的地域性特征, 其原因可能与忽地笑的地理分布范围广、生境条件复杂等因素有关。采用叶绿体基因psb A-trn H序列可以区分不同产地忽地笑居群, 可为准确鉴别忽地笑种源提供分子依据。
 
叶绿体基因psb A-trn H序列的系统发育树聚类结果与忽地笑产地的分布基本一致。12个湖南居群、6个贵州居群 (不含安顺) 、3个湖北居群 (不含十堰) 等样品聚为同一支, 其遗传距离为0~0.005 65;5个四川居群、4个云南居群等样品聚为另一支, 其遗传距离为0~0.003 76。这些结果表明, 我国忽地笑的种内 (居群) 亲缘关系与地理分布存在密切关系, 同一区域或地理分布越近, 其亲缘关系越近。从地理分布来看, 广东清远与湖南资兴2个居群之间地理位置相距不太远, 但其分类进化地位相差较远, 其遗传距离最大, 为0.009 47, 可能原因为地理隔离 (如南岭) 等因素使这些类群之间缺乏基因交流, 使其向不同进化方向演化, 产生了较大变异。例如, 与湖南资兴居群相比, 在第25 bp位点, 广东清远居群发生A/T颠换单一突变;在第54、58位点, A、T碱基均突变为G;在第138~226 bp位点, 广东清远居群插入TAG、TCCCCCG等碱基片段, 而湖南资兴居群缺失这89 bp片段等。从该系统进化树可以看出, 分布在华南的广东清远、东南部的福建惠安等忽地笑居群聚在整个系统发育树的底部分支, 是比较古老的类群;分布在我国华中地区的湖南、湖北以及中西部的贵州等区域的居群属较进化的类群, 提示忽地笑种质资源在我国的进化顺序为华南或东南部→华东地区→西南部→华中地区, 具体演化规律还有待后续深入研究。
 
综上所述, 通过叶绿体基因psb A-trn H序列对我国忽地笑种质资源的遗传多样性进行较深入分析, 发现我国不同产地忽地笑种质资源存在较大遗传变异, 并且在进化上存在明显的地域性特征;在分子生物学层面, 分析了52个不同产地忽地笑居群的系统进化关系, 为忽地笑种质资源鉴别、分类学研究及杂交育种等方面研究提供了参考依据。

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文章名称:不同产地忽地笑的叶绿体基因psb A-trn H序列分析

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