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多基原藏药材“美多罗米”中质量标志物的初步预测及分析

分类:(四) 发表时间:2019-08-19

多基原药材质量评价一直都是中药及民族药资源品质评价的重点和难点, 也是传统药物资源研究领域关注的热点[1]。藏药美多罗米是藏族民间常用药材, 飞蓬属和紫菀属多种植物不加区分
多基原药材质量评价一直都是中药及民族药资源品质评价的重点和难点, 也是传统药物资源研究领域关注的热点[1]。藏药“美多罗米”是藏族民间常用药材, 飞蓬属和紫菀属多种植物不加区分地作为该药材的基原使用。美多罗米最早收载于《晶珠本草》, 其性平, 味微苦, 具有清热解毒、治疗瘟疫等功效;《藏药志》记载, 美多罗米具有治疗眼痛、头痛等功效。前期本课题组已经对美多罗米多种基原进行了鉴定, 并对黄酮类化学成分及质量评价等进行了研究[2,3,4,5,6]。近年来, 课题组又发现美多罗米具有另一类含量较高的化合物, 即咖啡酸类成分, 并且该类成分具有抗心肌缺血的作用[7,8,9]。已有文献表明, 咖啡酸类成分还具有细胞保护、抗氧化、抗炎、免疫调节、抗菌、抗肿瘤等多种药理作用, 在防治氧化应激和炎症反应相关疾病中的应用具有潜在的价值[10,11,12,13]。
 
质量标志物 (Q-marker) 是2016年由刘昌孝院士提出的中药质量控制的新概念和新理论, 对中药以及民族药的质量控制具有非常重要的意义[14,15,16,17]。因此, 本课题借助Q-marker理论, 对多基原藏药材美多罗米, 包括紫菀属植物重冠紫菀Aster diplostephioides (DC.) C.B.Clarke.、飞蓬属植物多舌飞蓬Erigeron multiradiatus (Lindl.) Benth.和短葶飞蓬E.breviscapus (Vant.) Hand.-Mazz.的潜在Q-marker进行初步预测, 采用UHPLC法对3种基原植物及其花、茎、叶药用部位中初步预测的Q-marker的含量进行测定, 为全面评价美多罗米药材品质提供科学依据。
 
1 基于植物亲缘学与化学成分的特有性证据的Q-marker预测分析
200多年来, 学者们曾对紫菀属提出了许多分类方案, 但始终没有一个系统被认可。由于对紫菀属的定义不同, 因此该属所包括的种类有180~1 000种不同的统计[18]。狭义的紫菀属包括紫菀组、正菀组和山菀组, 在我国约100种, 狭义的飞蓬属包括飞蓬亚属Subgen.Erigeron和三型花亚属Subgen.Trimorpha 2个亚属35种。紫菀属和飞蓬属是形态特征十分复杂多样的类群, 紫菀属的定义、属内一些种的处理、组和系的划分等都存在很多疑问, 许多尚无定论的分类学问题仍未解决[19]。而多种飞蓬属和紫菀属植物也是藏药材美多罗米的基原, 由于飞蓬属和紫菀属植物在分类学上的分歧, 给植物分类学家带来了极大的困扰, 同时, 也给藏医药民间的使用造成极大的麻烦。藏药材美多罗米的基原植物较多, 后人的考证也未能确证, 各种文献著作收载的该药材基原都各不相同。根据《新修晶珠本草》和《藏药志》的考证结果来看, 藏医用药中基本确定来自飞蓬属4种和紫菀属15种植物。次生代谢产物的产生是环境与遗传基因共同作用的结果, 同时也与植物的生长发育阶段及部位有关系, 化学型是植物众多种类变异的一种, 不同的化学型其医药用途也完全不同。飞蓬属和紫菀属植物主要含有黄酮、咖啡酸类、植物甾醇、挥发油、氨基酸及微量元素等多种化学型, 既是紫菀属和飞蓬属植物中各个种的共性和普遍现象, 也是这两属植物生物多样性的独特表现形式。自20世纪70年代中期, 国内开始对灯盏花 (短葶飞蓬) 进行化学成分的研究, 其中灯盏乙素等多种黄酮类和咖啡酸类成分是其主要有效部位。在青藏高原东缘, 不同化学型的紫菀属植物和飞蓬属植物往往混杂生活在同一区域, 因而, 从植物形态上很难加以区分, 必须从植物体内的次生代谢产物包括化学成分的含量、化学型的组成等差异进行分析。
 
2 基于化学成分与有效性相关证据的Q-marker预测分析
美多罗米在传统藏医药中主要用于“龙”病的治疗, 现代药理学研究主要集中在灯盏花的研究, 具有改善微循环、扩张血管、镇静镇痛、抗炎作用, 还可抑制病变组织炎症介质及致痛物质的释放而起到抗炎作用等, 其主要活性成分包括以灯盏乙素为代表的黄酮类成分和咖啡酸类成分。课题组前期对多舌飞蓬的咖啡酸类成分进行了研究, 能够改善血流动力学行为, 保护心脏功能[7]。尽管美多罗米在藏医药中使用极为广泛, 但其现代药理学研究仍然是非常少的。因此, 根据已有的研究, 咖啡酸类成分 (绿原酸、咖啡酸、3, 4-二咖啡酰奎宁酸、3, 5-二咖啡酰奎宁酸、4, 5-二咖啡酰奎宁酸) 应该是美多罗米的主要活性物质基础之一, 可以作为Q-marker的主要选择。
 
3 美多罗米Q-marker的含量分析
3.1 仪器、材料与试剂
3.1.1 仪器
Waters Acquity H-Class UHPLC超高效液相色谱仪, 包括四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器以及Empower 3工作站 (美国Waters公司) ;ESJ-4B电子天平 (沈阳龙腾公司) 。3.1.2材料与试剂多舌飞蓬、重冠紫菀药材采于四川省甘孜藏族自治州炉霍县罗锅梁子, 短葶飞蓬购自成都荷花池药材市场, 经四川大学华西药学院张浩教授鉴定为菊科多舌飞蓬Erigeron multiradiatus (Wall.) Benth.、重冠紫菀Aster diplostephioides (DC.) C.B.Clarke.和短葶飞蓬Erigeron breviscapus (Vant.) Hand.-Mazz.。凭证标本 (EM-18-01、AD-18-01、EB-18-01) 存于西南民族大学青藏高原研究基地植物标本馆。
 
乙腈 (色谱纯, Fischer公司) , 3, 5-二咖啡酰奎宁酸 (批号15100702) 、3, 4-二咖啡酰奎宁酸 (批号15101132) 、4, 5-二咖啡酰奎宁酸 (批号15100816) 、咖啡酸 (批号1512071) 、绿原酸 (批号1512028) 购自成都康邦生物科技有限公司, 所有对照品经UHPLC峰面积归一化法计算质量分数均大于98%, 其他化学试剂为分析纯, 水为超纯水。
 
3.2 方法与结果
3.2.1 色谱条件
色谱柱为Acquity UHPLC HSS C18 (100 mm×2.1 mm, 1.8μm) ;流动相为乙腈 (A) -0.3%乙酸水 (B) , 梯度洗脱:0~2 min, 5%~13%A;2~6 min, 13%~16%A;6~9 min, 16%~23%A;9~15 min, 23%A;15~20 min, 23%~70%A;体积流量0.21 mL/min, 柱温35℃, 检测波长320 nm;进样量1μL。
 
3.2.2 对照品溶液的配制
精密称取对照品3, 5-二咖啡酰奎宁酸4.80 mg、咖啡酸1.90 mg、3, 4-二咖啡酰奎宁酸5.36 mg、绿原酸4.82 mg、4, 5-二咖啡酰奎宁酸5.04 mg, 于5 mL棕色量瓶中, 加甲醇超声溶解, 定容至刻度, 制成含3, 5-二咖啡酰奎宁酸0.96 mg/mL、3, 4-二咖啡酰奎宁酸1.03 mg/mL、4, 5-二咖啡酰奎宁酸1.01 mg/mL、咖啡酸0.38 mg/mL、绿原酸0.96 mg/mL的溶液, 精密吸取各对照品溶液适量于10 mL棕色量瓶中, 用甲醇定容, 即为混合对照品溶液, 冰箱保存, 备用。
 
3.2.3 供试品溶液的制备
准确称取样品粉末 (过5号筛) 0.5 g于50 mL具塞锥形瓶内, 加60%甲醇水30 mL, 密塞, 称定质量, 超声处理1 h, 放冷至室温, 再称定质量, 用60%甲醇水补足减失的质量, 摇匀, 10 000 r/min离心10 min, 取上清液过0.22μm滤膜, 即得。
 
3.2.4 线性关系考察
分别精密吸取5个对照品溶液0.2、0.4、0.8、1.6、2.0、2.8 m L于10 m L棕色容量瓶内, 加水定容至刻度, 以“3.2.1”项下色谱条件测定峰面积。以对照品质量浓度为横坐标 (X) , 峰面积为纵坐标 (Y) , 进行线性回归并绘制标准曲线, 以信噪比 (S/N) =3作为检测限 (LOD) , S/N=10作为定量限 (LOQ) , 见表1。
 
表1 5个成分的线性回归方程Table 1 Linear regression equations of five components     下载原表
 
 表1 5个成分的线性回归方程Table 1 Linear regression equations of five components
3.2.5 专属性试验
绿原酸、咖啡酸、3, 4-二咖啡酰奎宁酸、3, 5-二咖啡酰奎宁酸、4, 5-二咖啡酰奎宁酸的混合对照品溶液和多舌飞蓬、短葶飞蓬、重冠紫菀供试品溶液的UHPLC色谱图见图1, 混合对照品溶液及供试品溶液中5个咖啡酸类成分分离度良好。
 
3.2.6 精密度试验
精密吸取混合对照品溶液, 连续进样6次, 记录峰面积。结果绿原酸、咖啡酸、3, 4-二咖啡酰奎宁酸、3, 5-二咖啡酰奎宁酸、4, 5-二咖啡酰奎宁酸峰面积的RSD分别为0.85%、0.93%、0.98%、1.15%、0.71%, 表明仪器精密度良好。
 
3.2.7 稳定性试验
取多舌飞蓬样品粉末适量, 按照“3.2.3”项下方法制备供试品溶液, 以“3.2.1”项下色谱条件分别在0、3、6、9、12、16、20 h测定, 记录5个化合物的峰面积。结果多舌飞蓬样品中绿原酸、咖啡酸、3, 4-二咖啡酰奎宁酸、3, 5-二咖啡酰奎宁酸、4, 5-二咖啡酰奎宁酸峰面积的RSD分别为0.93、1.24%、1.43%、0.85%、1.22%, 结果表明供试品溶液在20 h内稳定性良好。
 
 图1 混合对照品 (A) 、多舌飞蓬 (B) 、重冠紫菀 (C) 、短葶飞蓬 (D) 的UHPLC色谱图Fig.1 UHPLC of mixed reference substances (A) , Erigeron multiradiatus sample (B) , Aster diplostephioides sample (C) , and Erigeron breviscapus sample (D)
图1 混合对照品 (A) 、多舌飞蓬 (B) 、重冠紫菀 (C) 、短葶飞蓬 (D) 的UHPLC色谱图Fig.1 UHPLC of mixed reference substances (A) , Erigeron multiradiatus sample (B) , Aster diplostephioides sample (C) , and Erigeron breviscapus sample (D)   下载原图
 
1-绿原酸2-咖啡酸3-3, 4二咖啡酰奎宁酸4-3, 5二咖啡酰奎宁酸5-4, 5二咖啡酰奎宁酸1-chlorogenic acid 2-caffeic acid 3-3, 4-dicaffeoylquinic acid 4-3, 5-dicaffeoylquinic acid 5-4, 5-dicaffeoylquinic acid
 
3.2.8 重复性试验
分别精密称取同一批多舌飞蓬样品粉末6份, 按照“3.2.3”项下方法制备供试品溶液, 分别测定, 记录峰面积。结果多舌飞蓬样品中绿原酸、咖啡酸、3, 4-二咖啡酰奎宁酸、3, 5-二咖啡酰奎宁酸、4, 5-二咖啡酰奎宁酸质量分数的RSD分别为1.25%、0.92%、1.14%、0.71%、1.16%, 表明该方法的重复性良好。
 
3.2.9 加样回收率试验
取已知含量的多舌飞蓬粉末6份, 精密称定, 分别精密加入一定量的对照品, 按“3.2.3”项下方法制备供试品溶液, 分别测定, 记录峰面积, 计算回收率, 绿原酸平均回收率为102.43% (RSD 0.99%) , 咖啡酸99.78% (RSD1.31%) , 3, 4-二咖啡酰奎宁酸99.39% (RSD 2.37%) , 3, 5-二咖啡酯奎宁酸103.12% (RSD 1.65%) , 4, 5-二咖啡酯奎宁酸101.83% (RSD 0.95%) 。结果表明该方法的准确度高。
 
3.2.1 0 样品测定
精密称取不同植物及不同部位样品粉末0.5 g, 根据“3.2.3”项的方法制备供试品溶液, 测定峰面积。根据回归方程计算5个咖啡酸类成分含量, 结果见表2。
 
表2 样品含量测定结果Table 2 Determination results of samples     下载原表
 
 表2 样品含量测定结果Table 2 Determination results of samples
4 讨论
本研究根据刘昌孝院士提出的“质量标志物”的理论, 对美多罗米多种基原药材的主要活性成分进行研究, 从化学成分与有效性相关的角度证明了美多罗米各基原药材选择咖啡酸类成分作为质量标志物之一的科学性。建立超高效液相色谱法测定重冠紫菀 (全草、茎、叶、花) 、多舌飞蓬 (全草、茎、叶、花) 、短葶飞蓬 (全草、茎、叶、花) 提取物中绿原酸、咖啡酸、3, 4-二咖啡酰奎宁酸、3, 5-二咖啡酰奎宁酸、4, 5-二咖啡酰奎宁酸含量, 该方法操作简单、精密度高、重复性好, 可用于同时测定美多罗米药材中5个咖啡酸类成分的含量。
 
结果显示, 重冠紫菀叶中绿原酸的含量最高, 为 (14.16±0.02) mg/g, 而多舌飞蓬茎中绿原酸含量最低, 为 (1.83±0.01) mg/g;短葶飞蓬叶中咖啡酸的含量最高, 为 (0.84±0.01) mg/g, 多舌飞蓬茎中咖啡酸含量最低, 为 (0.10±0.01) mg/g;短葶飞蓬叶中3, 4-二咖啡酰奎宁酸的含量最高, 为 (7.43±0.01) mg/g, 而重冠紫菀茎中3, 4-二咖啡酰奎宁酸的含量最低, 为 (0.28±0.01) mg/g;多舌飞蓬叶中3, 5-二咖啡酰奎宁酸的含量最高, 为 (19.63±0.04) mg/g, 而重冠紫菀茎中3, 5-二咖啡酰奎宁酸的量最低, 为 (0.43±0.03) mg/g;短葶飞蓬叶中3, 5-二咖啡酰奎宁酸的含量最高, 为 (13.91±0.02) mg/g, 重冠紫菀茎中3, 5-二咖啡酰奎宁酸的含量最低, 为 (0.14±0.00) mg/g。表明咖啡酸类成分为美多罗米各基原植物及部位中的主要成分组之一, 在不同药用部位中存在一定的差异, 作为质量标志物评价其资源品质是合理的, 基于多指标成分对质量标志物进行预测分析, 对多基原药材进行质量评价具有重要的意义。
 
后续将根据中药质量标志物的研究模式, 开展藏药材美多罗米的更多基原植物的研究, 以期为美多罗米的质量控制奠定坚实的基础, 同时为中药质量标志物理论在民族药尤其是多基原药材中的应用提供新思路。

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