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红芪中5种黄酮类成分对大鼠骨髓间充质干细胞和成骨细胞成骨分化的影

分类:(四) 发表时间:2019-08-20

随着人口日趋老龄化, 骨质疏松症的发病率逐年上升, 对人类健康构成很大威胁[1,2]。迄今, 利用中医药治疗骨质疏松症已受到越来越多研究者的关注[3]。红芪是豆科植物多序岩黄芪Hedy
随着人口日趋老龄化, 骨质疏松症的发病率逐年上升, 对人类健康构成很大威胁[1,2]。迄今, 利用中医药治疗骨质疏松症已受到越来越多研究者的关注[3]。红芪是豆科植物多序岩黄芪Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz.的干燥根。基于课题组前期研究, 红芪已被证实具有抑制骨吸收, 刺激骨形成, 预防去卵巢所致骨质疏松症作用[4,5]。但目前多数红芪抗骨质疏松的研究都集中在粗提取物上, 难以描述发挥疗效的物质基础。大量研究表明黄酮类化合物具有显著的抗骨质疏松作用[6,7,8,9,10]。柚皮苷剂量依赖性刺激体外培养骨髓间充质干细胞 (BMSCs) 和成骨细胞的增殖, 提高碱性磷酸酶 (ALP) 活性, 具有较强的骨保护活性[11]。丁淑琴等[12]发现山柰酚显著提高去卵巢大鼠骨密度, 明显抑制大鼠尿液中骨钙和磷的流失。
 
本研究比较红芪中5种主要黄酮类化合物[13] (毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、异甘草素和美迪紫檀素) 体外对大鼠BMSCs (r BMSCs) 和成骨细胞的增殖、分化和矿化的影响, 并将这几种化合物的成骨效力与其内在的分子结构差异进行比较, 为5种黄酮类化合物构效关系的研究提供理论基础和依据。
 
1 材料
1.1 仪器
BS224S/BP211D电子分析天平 (Sartorius, 德国) ;调速平板振荡器 (姜堰市新康医疗器械有限公司) ;倒置相差显微镜 (Olympus, 日本) ;CO2细胞培养箱 (LabServ, 美国) ;Vaioskan Flash多功能酶标仪 (美国赛默飞世尔公司) ;移液枪 (Eppendorf, 德国) 。
 
1.2 药物与试剂
美迪紫檀素 (质量分数>98%, 批号CFS201501, Chem Faces公司) ;芒柄花苷 (质量分数>98%, 批号M-013-171216, 成都瑞芬思生物科技有限公司) ;芒柄花素 (质量分数>98%, 批号111703-200603, 中国食品药品检定研究院) ;毛蕊异黄酮 (质量分数>98%, 批号20575-57-9, 宝鸡市辰光生物科技有限公司) ;异甘草素 (质量分数>98%, 批号Y-008-161216, 成都瑞芬思生物科技有限公司) ;胎牛血清 (CLARK公司) ;II型胶原酶 (BIOSHARP公司) ;青霉素、链霉素、DMEM培养基、DMEM/F12培养基均购自Hyclone公司;胰蛋白酶、地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠均购自索莱宝公司;ALP试剂盒 (批号20180614) 、Ca试剂盒 (批号20180704) 均购自南京建成生物工程研究所;二甲基亚砜 (DMSO) , Sigma公司。
 
1.3 实验动物
1月龄SD雄性大鼠, 体质量120~170 g;出生48 h以内SD大鼠乳鼠, 体质量25~30 g;均由兰州大学实验动物中心提供, 动物许可证号SCXK (甘) 2013-0002。
 
2 方法
2.1 r BMSCs的分离培养
参考郭晓宇等[14]方法, 将5只约150 g的1月龄SD雄性大鼠脱颈椎处死, 75%乙醇浸泡消毒10min, 无菌剥离股骨和胫骨, 剪去两端骨骺后将DMEM/F12培养基 (含10%胎牛血清, 100 U/mL青霉素和1 000 U/mL链霉素) 注入骨髓腔并反复冲洗, 收集细胞悬液, 并通过200目细胞筛得到单细胞悬液, 吹打均匀。将收集的细胞调整细胞密度为1×107个/mL, 接种于25 cm2的培养瓶中。37℃、5%CO2培养箱中培养, 次日换液, 之后每2~3天更换1次培养基, 并用无菌磷酸盐缓冲液 (PBS, pH 7.4) 洗涤3遍。当细胞达到80%以上融合时, 0.25%胰蛋白酶消化传代用于实验。
 
2.2 颅骨成骨细胞 (rat calvarial osteoblasts, ROBs) 的分离培养
大鼠颅骨成骨细胞的分离培养采用酶消法。参考方清清等[15]方法, 取10只新生SD大鼠乳鼠, 75%乙醇消毒10 min后, 无菌条件下取颅骨, 剔除血管及结缔组织。用无菌PBS冲洗2遍, 将颅骨剪碎至1~2 mm3。碎骨片装入无菌培养瓶中, 加入0.5mg/mL胰蛋白酶于37℃恒温震荡消化2次, 每次10 min, 弃去消化液。再加入1 mg/mL II型胶原酶于37℃恒温震荡消化6次, 每次15 min。收集最后4次消化上清液并通过200目细胞筛滤过以除去骨碎片。将收集的单细胞悬液调整细胞密度为3×104个/mL, 接种于25 cm2的培养瓶中。37℃、5%CO2培养箱中培养, 次日换液, 之后每2~3天更换1次培养基, 并且用PBS洗涤3遍。当细胞达到80%以上融合时, 用胰蛋白酶进行消化传代进行实验。
 
2.3 药物溶液配制及分组
精密称取5种黄酮类化合物 (毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、异甘草素和美迪紫檀素) , 溶解于DMSO中, 分别制成浓度为1×10-5、1×10-4、1×10-3、0.01、0.1 mol/L的保存液。给药组:各保存液分别加入培养基中制备成单体成分溶液, 使终浓度分别为1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5 mol/L;对照组加入不含药物的培养液 (DMSO终体积分数小于0.05%) 。每组设5个复孔。
 
2.4 MTT法检测细胞增殖
rBMSCs或ROBs细胞以1×104个/孔铺板于96孔板, 细胞贴壁后, 加药, 每孔100μL, 培养24、48 h后, 每孔避光加入10μL MTT, 37℃避光孵育4 h, 弃去培养基, 加入100μL DMSO, 振摇20 min, 于酶标仪490 nm处测吸光度 (A) 值, 计算增殖率。
 
增殖率=A加药/A对照
 
2.5 ALP活性测定
将P1代细胞以1×104个/孔铺板于12孔板, 待细胞长满至90%以上, 更换成骨诱导培养基 (含有1×10-8 mol/L地塞米松, 10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠和50mg/L抗坏血酸) , 诱导培养8 d, 每3天更换含药 (不同浓度的受试化合物) 培养基, 按照ALP试剂盒方法检测ALP活性, 结果以nmol/ (min·mg) 表示[16]。
 
2.6 Ca2+的测定
5种成分以增强ALP活性的最佳浓度, 分别给药6 d后, 收集分离的细胞上清液, 通过Ca2+测试盒测定上清液中Ca2+的含量。
 
2.7 茜素红染色
将P1代细胞以1×104个/孔铺板于12孔板, 待细胞长满至90%以上, 更换成骨诱导培养基, 以增强ALP活性的最佳浓度的上述5种成分分别加入培养液中, 处理培养12 d后评估形成的钙化结节, 并通过选择性结合钙的茜素红染色来测定。染色后照相记录, 并使用Image-Pro Plus 6.0软件扫描, 统计钙化结节染色阳性区域的面积和数量。
 
2.8 统计学分析
采用SPSS 19.0软件统计并分析, 各组数据均采用 表示, 每组处理平行重复3次, 组间比较采用单因素方差分析。
 
3 结果
3.1 5种黄酮类化合物对r BMSCs的作用
3.1.1 5种黄酮类化合物对rBMSCs增殖的影响
从表1可以看出作用24、48 h后, 各化合物对r BMSCs均没有细胞毒性作用, 与对照组比较, 1×10-9~1×10-7 mol/L的美迪紫檀素对细胞增殖有极显著的促进作用 (P<0.01) , 1×10-7~1×10-6 mol/L的毛蕊异黄酮、芒柄花素和芒柄花苷显著促进细胞增殖 (P<0.05、0.01) 。与对照组相比, 异甘草素作用24 h对rBMSCs的增殖没有显著性影响。1×10-6 mol/L的芒柄花苷作用24 h促进rBMSCs增殖能力最强, 增殖率为 (124.70±3.89) %。
 
3.1.2 5种黄酮类化合物对rBMSCs ALP活性的影响
ALP活性的提高是BMSCs向成骨细胞分化的重要标志。给药8 d后, 5种化合物作用后其细胞中的ALP活性均较对照组显著升高 (P<0.05) 。毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷和异甘草素提高ALP活性的最佳浓度均是1×10-6 mol/L, 而美迪紫檀素的最佳浓度是1×10-9 mol/L。并且在最佳浓度条件下, 增加rBMSCs ALP活性能力大小依次是毛蕊异黄酮>芒柄花苷>美迪紫檀素>芒柄花素>异甘草素。结果见表2。
 
表1 毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、异甘草素和美迪紫檀素对rBMSCs增殖的影响 Table 1 Effects of calycosin, formononetin, ononin, isoliquiritigenin, and medicarpin on cell proliferation of r BMSCs      下载原表
 
 表1 毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、异甘草素和美迪紫檀素对rBMSCs增殖的影响 Table 1 Effects of calycosin, formononetin, ononin, isoliquiritigenin, and medicarpin on cell proliferation of r BMSCs
与对照组比较:*P<0.05**P<0.01, 下同*P<0.05**P<0.01 vs control group, same as below
 
3.1.3 5种黄酮类化合物对rBMSCs中Ca2+水平的影响
图1结果显示, 各给药组Ca2+水平均高于对照组, 除芒柄花素和异甘草素差异不显著外, 其余差异均显著 (P<0.05、0.01) , 另外各给药组Ca2+水平高低依次是毛蕊异黄酮>芒柄花苷>美迪紫檀素>芒柄花素>异甘草素。
 
表2 毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、异甘草素和美迪紫檀素对rBMSCs中ALP活性的影响 Table 2 Effects of calycosin, formononetin, ononin, isoliquiritigenin, and medicarpin on alkaline phosphatase (ALP) activity in rBMSCs      下载原表
 
 表2 毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、异甘草素和美迪紫檀素对rBMSCs中ALP活性的影响 Table 2 Effects of calycosin, formononetin, ononin, isoliquiritigenin, and medicarpin on alkaline phosphatase (ALP) activity in rBMSCs
 图1 毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、异甘草素和美迪紫檀素对rBMSCs中Ca2+水平的影响 (x±s, n=3) Fig.1 Effects of calycosin, formononetin, ononin, isoliquiritigenin, and medicarpin on Ca2+levels in rBMSCs (x±s, n=3)
图1 毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、异甘草素和美迪紫檀素对rBMSCs中Ca2+水平的影响 (x±s, n=3) Fig.1 Effects of calycosin, formononetin, ononin, isoliquiritigenin, and medicarpin on Ca2+levels in rBMSCs (x±s, n=3)   下载原图
 
3.1.4 5种黄酮类化合物对rBMSCs钙化结节形成的影响
钙化结节的形成是成骨细胞成熟的标志之一。在茜素红染色后, 钙化的结节呈现鲜红色 (图2) 。第12天的钙化结节形成测定揭示了与ALP测定结果相似的趋势。5种黄酮类成分作用的rBMSCs中钙化结节的形成增加, 不论钙化结节数量还是面积都极显著高于对照组 (P<0.01) 。各给药组钙化结节数量大小依次是毛蕊异黄酮>芒柄花苷>美迪紫檀素>芒柄花素>异甘草素;各给药组钙化结节面积大小依次是毛蕊异黄酮>芒柄花苷>美迪紫檀素>异甘草素>芒柄花素。
 
3.2 5种黄酮类化合物对ROBs的影响
3.2.1 5种黄酮类化合物对ROBs增殖的影响
从表3可以看出, 给药24、48 h后, 各化合物对ROBs均没有细胞毒性作用, 与对照组比较, 1×10-9~1×10-8 mol/L美迪紫檀素及1×10-7~1×10-6 mol/L芒柄花素和芒柄花苷对ROBs增殖有极显著的促进作用 (P<0.01) , 1×10-8~1×10-7 mol/L毛蕊异黄酮和1×10-6~1×10-5 mol/L异甘草素显著促进细胞增殖 (P<0.05) , 1×10-9 mol/L美迪紫檀素作用24 h促进ROBs增殖能力最强, 增殖率为 (122.00±1.01) %。
 
3.2.2 5种黄酮类化合物对ROBs ALP活性的影响
ALP活性是成骨细胞早期分化的表型标记。给药8 d后, 5种化合物均提高ROBs ALP活性, 并显著高于对照组 (P<0.05、0.01) 。毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷和异甘草素的最佳浓度均是1×10-6mol/L, 而美迪紫檀素的最佳浓度是1×10-9 mol/L。在最佳浓度下, 增强ALP活性能力大小依次是美迪紫檀素>毛蕊异黄酮>芒柄花苷>芒柄花素>异甘草素。结果见表4。
 
 图2 毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、异甘草素和美迪紫檀素对rBMSCs钙化结节形成的影响 Fig.2 Effects of calycosin, formononetin, ononin, isoliquiritigenin, and medicarpin on calcified nodules of rBMSCs
图2 毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、异甘草素和美迪紫檀素对rBMSCs钙化结节形成的影响 Fig.2 Effects of calycosin, formononetin, ononin, isoliquiritigenin, and medicarpin on calcified nodules of rBMSCs    下载原图
 
表3 毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、异甘草素和美迪紫檀素对ROBs增殖的影响 Table 3 Effects of calycosin, formononetin, ononin, isoliquiritigenin, and medicarpin on cell proliferation of ROBs      下载原表
 
 表3 毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、异甘草素和美迪紫檀素对ROBs增殖的影响 Table 3 Effects of calycosin, formononetin, ononin, isoliquiritigenin, and medicarpin on cell proliferation of ROBs
3.2.3 5种黄酮类化合物对ROBs Ca2+水平的影响
图3结果显示, 各给药组Ca2+水平均显著高于对照组 (P<0.05) , 另外各给药组Ca2+水平高低依次是美迪紫檀素>毛蕊异黄酮>芒柄花苷>芒柄花素>异甘草素。
 
3.2.4 5种黄酮类化合物对ROBs钙化结节形成的影响
化合物均以提高ALP活性的最佳浓度给药12 d后, 茜素红染色结果见图4, 与对照组相比, 5种化合物显著促进了ROBs钙化结节的数量和面积 (P<0.05) , 细胞成熟矿化程度明显增加。各组钙化结数量大小依次是美迪紫檀素>毛蕊异黄酮>芒柄花苷>芒柄花素>异甘草素;各组钙化结节面积大小依次是美迪紫檀素>毛蕊异黄酮>芒柄花苷>芒柄花素>异甘草素。
 
表4 毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、异甘草素和美迪紫檀素对ROBs中ALP活性影响 Table 4 Effects of calycosin, formononetin, ononin, isoliquiritigenin, and medicarpin on ALP activity in ROBs      下载原表
 
 表4 毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、异甘草素和美迪紫檀素对ROBs中ALP活性影响 Table 4 Effects of calycosin, formononetin, ononin, isoliquiritigenin, and medicarpin on ALP activity in ROBs
 图3 毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、异甘草素和美迪紫檀素对ROBs中Ca2+水平的影响 Fig.3 Effects of calycosin, formononetin, ononin, isoliquiritigenin, and medicarpin on Ca2+levels in ROBs
图3 毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、异甘草素和美迪紫檀素对ROBs中Ca2+水平的影响 Fig.3 Effects of calycosin, formononetin, ononin, isoliquiritigenin, and medicarpin on Ca2+levels in ROBs    下载原图
 
4讨论
骨质疏松症是骨吸收大于骨形成的代谢失衡结果。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞, 主要起源于具有自我复制和众多分化潜能的BMSCs, 增强成骨细胞的活性以及抑制破骨细胞增殖可以帮助恢复骨代谢平衡, 因此加强BMSCs向成骨细胞分化, 对骨质疏松的治疗具有重要意义[17,18]。现今, 黄酮类物质治疗骨质疏松症和骨保护作用的研究已引起颇多研究者的关注。
 
 图4 毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、异甘草素和美迪紫檀素对ROBs钙化结节形成的影响 Fig.4 Effects of calycosin, formononetin, ononin, isoliquiritigenin, and medicarpin on calcified nodules of ROBs
图4 毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、异甘草素和美迪紫檀素对ROBs钙化结节形成的影响 Fig.4 Effects of calycosin, formononetin, ononin, isoliquiritigenin, and medicarpin on calcified nodules of ROBs    下载原图
 
本研究探讨了红芪中5种主要黄酮类成分对BMSCs和ROBs增殖、分化和矿化的影响。实验发现毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷和异甘草素这4种化合物在1×10-6 mol/L下可刺激rBMSCs和ROBs的成骨性分化, 而美迪紫檀素在1×10-9mol/L下就可以显著促进2种细胞的增殖、分化和矿化。另外, 芒柄花苷较芒柄花素在促进rBMSCs和ROBs增殖、分化和矿化方面能力更强。与芒柄花素相比, 芒柄花苷在化学结构上更复杂, 它是1种在C-7位上带有葡萄糖基团的黄酮苷, 这表明可能葡萄糖基团有利于成骨活性。
 
本研究还发现毛蕊异黄酮较芒柄花素更加有效地促进r BMSCs和ROBs的分化和成熟。毛蕊异黄酮的化学结构与芒柄花素的化学结构类似, 仅在环B的C-3位取代基不同, 毛蕊异黄酮是羟基, 芒柄花素是氢基。黄酮类分子结构中羟基的数量和位置是产生雌激素活性的重要因素[19], 一般情况下黄酮类分子母核上的羟基取代程度越大, 活性越强[20], 毛蕊异黄酮比芒柄花素多一个羟基取代基, 这可能是毛蕊异黄酮在增强成骨活性方面比芒柄花素更有效的原因。实验中异甘草素促进r BMSCs和ROBs的增殖分化能力最弱, 其骨架是二氢黄酮的C环开环形成的查耳酮类, 其他4种化合物均是或类似于甲氧基异黄酮结构, 羰基、甲氧基和羟基的氧原子是异黄酮类化合物表现出抗骨质疏松症活性最活跃的部位[21]。上述化合物促进骨形成的作用机制仍有待确定。
 
综上所述, 本研究为红芪防治骨质疏松症[22]提供了科学依据和支持, 红芪中的主要黄酮类成分美迪紫檀素、芒柄花苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮和异甘草素, 具有增强r BMSCs和ROBs的成骨活性的能力, 具有潜在的增强骨骼强度和治疗骨质疏松症的能力。

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文章名称:红芪中5种黄酮类成分对大鼠骨髓间充质干细胞和成骨细胞成骨分化的影

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