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桂枝茯苓胶囊中三萜酸类成分的UPLC/Q-TOF-MS指纹图谱研究

分类:(四) 发表时间:2019-08-20

桂枝茯苓胶囊 (Guizhi Fuling Capsule, GFC) 处方源自汉代名医张仲景《金匮要略》中的经典方剂桂枝茯苓丸, 由桂枝、牡丹皮、桃仁、白芍和茯苓5味中药材组成, 具有活血、化瘀、消癥的功效
桂枝茯苓胶囊 (Guizhi Fuling Capsule, GFC) 处方源自汉代名医张仲景《金匮要略》中的经典方剂桂枝茯苓丸, 由桂枝、牡丹皮、桃仁、白芍和茯苓5味中药材组成, 具有活血、化瘀、消癥的功效, 用于治疗妇科血瘀症、子宫肌瘤、慢性盆腔炎、卵巢囊肿、原发性痛经、子宫内膜异位症等疾病[1,2,3,4,5,6,7,8]。近年来, 由于妇科疾病患者的增多, GFC的用量也在逐渐增加, 因此对其质量标准的进一步完善与提高提出了新的要求。目前, GFC在《中国药典》2015年版一部[9]中主要采用液相指纹图谱结合定量测定、TLC方法检测处方中的白芍、牡丹皮、桃仁和桂枝药材, 采用显微鉴别方法鉴别茯苓, 却未见对茯苓中的化学成分进行质量控制, 而作为佐药的茯苓, 其三萜酸类成分具有抗炎、免疫调节等药理作用[10,11], 与GFC临床疗效相关, 也是其重要的有效成分[12,13,14,15], 因此有必要对此类成分进行质量控制。迄今为止对该类成分的质量控制方面报道较少[16,17,18]。为了更好地反映GFC的内在质量, 本实验首次运用UPLC/Q-TOF-MS对GFC中三萜酸类成分的指纹图谱进行研究, 为完善GFC的质量控制标准提供了参考。
 
1 仪器和材料
Agilent 1290-6538液质联用仪;MettLer Tol-edo XP6电子分析天平, 瑞士梅特勒公司;Sartorius BSA224S-CW电子分析天平, 德国赛多利斯公司;Centrifuge 5415D台式高速冷冻离心机, 德国Epperdorf公司;GL-88B涡旋混合器, 海门市其林贝尔仪器制造有限公司;H1650-W台式高速离心机, 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;Milli-Q Academic纯水机, 美国密理博公司。
 
茯苓酸、去氢茯苓酸、去氢土莫酸、去氢齿孔酸、猪苓酸C和松苓新酸对照品, 由本实验室自制, 经面积归一化法测定质量分数≥98%;GFC由江苏康缘药业股份有限公司提供, 规格:0.31 g/粒, 100粒/盒, 批号140702、150601、150902、160202、160301、160302、160401、160701、160802、170230, 分别编号S1~S10。乙腈, 色谱纯, 德国默克公司;甲酸, 色谱纯, 美国ACS恩科化学公司;甲醇, 色谱纯, 美国天地公司;醋酸乙酯, 分析纯, 南京化学试剂有限公司;超纯水, 自制。
 
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为Agilent RRHD SB-C18柱 (100 mm×2.1 mm, 1.8μm) ;流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液, 洗脱程序:0~20 min, 52%乙腈;20~23 min, 52%~65%乙腈;23~27 min, 65%~70%乙腈;27~31min, 70%乙腈;31~45 min, 70%~78%乙腈;45~52 min, 78%~84%乙腈;52~54 min, 84%~90%乙腈;54~65 min, 90%乙腈;体积流量0.2 mL/min;柱温25℃;进样量1μL。理论塔板数以茯苓酸计算应不低于100 000。
 
2.2 质谱条件
电喷雾离子源 (ESI) , 离子模式:负离子模式;质量扫描范围m/z 100~3 000;干燥气温度350℃;干燥气体积流量10 L/min;雾化气压力310 kPa;毛细管电压, 负离子模式3 500 V;源内裂解电压135V;仪器分辨率大于20 000。
 
2.3 对照品溶液的配制
分别精密称取茯苓酸、去氢茯苓酸、去氢土莫酸、去氢齿孔酸、猪苓酸C、松苓新酸对照品适量, 精密称定, 用甲醇定容制得各成分质量浓度均为10μg/mL的混合对照品溶液, 于4℃保存, 备用。
 
2.4 供试品溶液的制备
取GFC 20粒, 内容物, 混匀, 取约3.1 g, 精密称定, 置于100 m L量瓶中, 加入醋酸乙酯溶液60 m L, 超声提取 (功率250 W, 频率50 kHz) 2次, 每次30 min, 滤过, 减压浓缩 (40℃) 至干, 用甲醇溶解定容至25 mL量瓶中, 摇匀, 静置, 0.22μm微孔滤膜滤过, 备用。
 
2.5 方法学考察[17]
2.5.1 精密度考察
精密称取同一批GFC, 按上述“2.4”项下的方法制备供试品溶液, 按“2.1”项下的色谱条件连续进样6次, 记录色谱图, 以去氢茯苓酸为参照峰 (S) , 计算主要色谱峰相对保留时间及主要色谱峰的相对峰面积。结果RSD均小于5.0%。以第1次进样所得图谱作为对照计算后5次进样所得指纹图谱的相似度, 结果均大于0.99。表明仪器进样精密度良好, 符合指纹图谱分析要求。
 
2.5.2稳定性考察
精密称取同一批GFC, 按上述“2.4”项下的方法制备供试品溶液, 按“2.1”项下的色谱条件分别在0、2、4、6、8、12、24 h进样分析, 以去氢茯苓酸为参照峰 (S) , 计算主要色谱峰相对保留时间及主要色谱峰的相对峰面积。结果RSD均小于4.86%。以0 h进样所得图谱做为对照计算后6个时间点进样所得指纹图谱的相似度, 结果均大于0.99。表明供试品溶液在室温24 h内是稳定的。
 
2.5.3 重复性考察
精密称取同一批GFC 6份, 按上述“2.4”项下的方法制备供试品溶液, 按“2.1”项下的色谱条件进样分析, 记录色谱图, 以去氢茯苓酸为参照峰 (S) , 计算主要色谱峰相对保留时间及主要色谱峰的相对峰面积。结果RSD均小于4.47%。以第1份进样所得图谱作为对照计算后5份进样所得指纹图谱的相似度, 结果均大于0.99。表明该方法重复性好, 符合指纹图谱分析要求。
 
2.6 指纹图谱研究
2.6.1 指纹图谱的建立
分别精密吸取10批GFC制备的供试品溶液, 按“2.1”项下的色谱条件及“2.2”项下的质谱条件, 依法测定, 记录总离子流 (TIC) 图, 将所得的10批样品图谱代入到“中药色谱指纹图谱相似度评价系统 (2012.130723版本) ”中, 设定第S1批样品图谱为参照图谱, 同时以峰5、6、7进行多点校正, 自动匹配色谱峰, 采用平均数法生成GFC的对照指纹图谱, 并对各批次指纹图谱进行叠加, 得到10批GFC样品的指纹图谱, 见图1。
 
2.6.2 相似度分析
采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统 (2012.130723版本) ”软件, 对10批GFC中三萜酸类成分指纹图谱的实验数据进行分析, 计算各批次样品与对照指纹图谱的相似度, 结果相似度在0.978~0.998, 见表2。
 
 图1 10批GFC样品中三萜酸类成分的指纹图谱及其对照指纹图谱 (R) Fig.1 Fingerprint for ten batches of triterpenic acid in GFC and its reference fingerprint (R)
图1 10批GFC样品中三萜酸类成分的指纹图谱及其对照指纹图谱 (R) Fig.1 Fingerprint for ten batches of triterpenic acid in GFC and its reference fingerprint (R)   下载原图
 
2.6.3 共有峰的标定
根据10个不同批次的GFC的检测结果, 比较各个色谱图, 以色谱峰的相对保留时间标定出10批谱图的共有峰26个, 见图1-R, 根据对照品的比对及色谱图的保留时间及质谱信息, 确定色谱峰18为去氢茯苓酸, 以去氢茯苓酸为参照峰 (S) , 计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积, 结果发现10批GFC样品图谱中共有峰的相对保留时间RSD值均小于0.43%, 相对峰面积的RSD值均小于30%, 说明所建立的指纹图谱符合国家标准。
 
2.7 指纹图谱中共有峰的归属
分别精密称取GFC成品和桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、白芍药材适量, 按上述“2.4”项下的方法制备供试品溶液, 按“2.1”项下的色谱条件, 依法测定, 得到相应TIC图, 将样品图谱代入到“中药色谱指纹图谱相似度评价系统 (2012.130723版本) ”中, 得到5味药与GFC相匹配的色谱图, 按照各色谱峰的保留时间、峰形、以及质谱信息等, 确认指纹图谱共有峰与单味药材图谱的相关性, 结果见图2。指纹图谱中共有26个共有峰, 其中3、5~18、20、23、24号峰来自茯苓, 2号峰来自于白芍和牡丹皮药材, 4号峰来自于茯苓、牡丹皮、白芍、桂枝药材, 19号峰来自于牡丹皮、白芍和桂枝药材, 21号峰来自于牡丹皮和白芍药材, 22、25号峰来自于茯苓、牡丹皮、桃仁、白芍、桂枝药材, 26号峰来自于桂枝、白芍、桃仁药材。
 
表2 相似度评价结果Table 2 Similarity evaluation results     下载原表
 
 表2 相似度评价结果Table 2 Similarity evaluation results
 图2 GFC部分特征峰的归属Fig.2 Characteristic peak assignments in fingerprint of GFC
图2 GFC部分特征峰的归属Fig.2 Characteristic peak assignments in fingerprint of GFC   下载原图
 
2.8 共有峰的指认
分别精密吸取混合对照品溶液及按上述“2.4”项下的方法制备供试品溶液, 按“2.1”项下的色谱条件及“2.2”项下的质谱条件, 依法测定, 对比样品中各色谱峰保留时间及质谱信息, 对样品中的共有峰进行指认, 结果见表3和图5。
 
3 讨论
3.1 色谱条件
UPLC比一般HPLC具有更高的选择性和分离度, 通过不同溶剂系统 (乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液和乙腈-0.3%甲酸水溶液) 对三萜酸类成分分离效果影响的实验比较。结果乙腈-0.1%甲酸水溶液系统色谱峰较多, 峰形及响应较好, 同时考虑到pH偏低会影响色谱柱使用的寿命, 故最终选择流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液;考察不同的体积流量 (0.2、0.3、0.4 mL/min) , 发现体积流量为0.2 mL/min时, 茯苓酸与邻近峰的分离度及峰型均较好, 且色谱峰响应最高, 故最终体积流量确定为0.2 mL/min。
 
表3 对照品保留时间与色谱峰的归属Table 3 Attribution of retention time and chromatographic peak     下载原表
 
 表3 对照品保留时间与色谱峰的归属Table 3 Attribution of retention time and chromatographic peak
 图5 混合对照品 (A) 及样品 (B) 的TIC Fig.5 TIC of mixed reference solution (A) and sample solution (B)
图5 混合对照品 (A) 及样品 (B) 的TIC Fig.5 TIC of mixed reference solution (A) and sample solution (B)   下载原图
 
3.2 供试品制备方法
对制剂样品前处理过程中, 以甲醇、95%乙醇、醋酸乙酯为提取溶剂, 采用超声提取与回流提取法, 同时考察提取次数、溶剂用量以及时间对实验结果的影响。结果发现醋酸乙酯的提取效果更好, 原因可能是醋酸乙酯较甲醇、95%乙醇的极性小, 与三萜酸类成分的极性更接近, 由于相似相溶作用, 成分提取的更完全。最终确定供试液最佳提取条件为醋酸乙酯为提取溶剂, 溶剂用量为60 m L, 超声提取2次, 每次提取30 min。
 
3.3 峰归属
在前期的文献总结中发现三萜酸类成分的分子量在400~600。通过对比GFC制剂与处方中药材的指纹图谱及其各色谱峰的质谱信息, 对制剂中各共有峰进行归属, 归属分析可得出各共有峰的药材来源, 其中3、5~18、20、23、24号峰来自于茯苓药材中, 且相对分子质量均在400~600, 因此, GFC中的三萜酸类成分主要来自于茯苓药材中。
 
3.4 小结
所建立的GFC中三萜酸类成分UPLC/Q-TOF-MS指纹图谱, 共标定了26个共有峰, 相似度在0.978~0.998, 说明不同批次间GFC的化学组成一致性较好, 所选择的原药材的质量较一致, 且各生产工艺过程较稳定。该方法灵敏度高, 稳定可靠, 重现性好, 可为GFC的质量标准提升提供参考, 也可为含有茯苓药材的中药成方制剂中控制三萜酸类成分提供一种新的方法。
 
3.5 方法优势
本实验采用UPLC/Q-TOF-MS建立GFC中三萜酸类成分的指纹图谱, 与HPLC相比, 该方法具有较高的灵敏度、选择性和专属性, 利用质谱的优势, 可以全面地反映出GFC中三萜酸类成分的化合物信息, 可为GFC的质量标准提升提供参考方法, 而且该方法不但丰富了GFC指纹图谱研究的思路, 也为其后期的化学成分研究和物质基础的进一步研究奠定了基础。

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文章名称:桂枝茯苓胶囊中三萜酸类成分的UPLC/Q-TOF-MS指纹图谱研究

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