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正交设计结合药效学实验优选桂栀助眠胶囊提取工艺研究

分类:(四) 发表时间:2019-08-20

桂栀助眠方是第6批全国老中医药专家学术继承指导老师邓家刚教授根据长期从事临床和中药研究的实践, 结合经典名方交泰丸的立意, 选用肉桂、栀子2味药食两用药材, 用于辅助治疗心
桂栀助眠方是第6批全国老中医药专家学术继承指导老师邓家刚教授根据长期从事临床和中药研究的实践, 结合经典名方“交泰丸”的立意, 选用肉桂、栀子2味药食两用药材, 用于辅助治疗心肾不交、心火偏亢所致的失眠症。君药栀子具有清心除烦之功效[1], 其有效成分栀子苷具有改善睡眠的作用[2], 反佐药肉桂具有补火助阳、引火归元之功效[1], 挥发油是肉桂镇静安神的化学物质基础[3,4,5]。本课题组为了将桂栀助眠方开发成具有改善睡眠功效的中药保健食品, 采取正交设计结合药效学实验优选桂栀助眠胶囊 (Guizhi Sleeping Capsules, GSC) 最佳提取工艺, 为GSC的研发提供实验依据。
 
1 仪器与试药
1.1 仪器
Waters 2695型高效液相色谱仪, 美国Waters公司;RE-52AA型真空旋转蒸发器, 上海亚荣生化仪器厂;SHB-IIIA型循环水式多用真空泵, 郑州长城科工贸有限公司;ELMA Elmasonic P120H型超声波清洗器, 德国Elma公司;Mettler Toledo ME204型万分之一电子分析天平, 瑞士Mettler Toledo公司;FD56型恒温鼓风干燥箱, 上海合测实业有限公司;DZF-6050型真空干燥箱, 上海一恒科学仪器有限公司;HDM-500型恒温电热套, 江苏天由有限公司;JG-30型高速万能粉碎机, 上海市精益工贸有限公司;TGL-16M型医用离心机, 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;HH-S8数显型恒温水浴锅, 金坛市医疗仪器厂。
 
1.2 试药
栀子, 批号20180117, 南宁市京昌中药饮片有限公司;肉桂, 批号20180101, 南宁生源中药饮片有限责任公司;以上药材经广西中医药大学药学院韦松基教授鉴定栀子为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实, 肉桂为樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl.的干燥树皮, 均符合《中国药典》2015年版规定;栀子苷对照品, 批号11079-201718, 质量分数97.6%, 中国食品药品检定研究院;地西泮片, 上海上药信谊药厂有限公司, 批号14170401W;0.9%氯化钠注射液, 回音必集团 (江西) 东亚制药有限公司, 批号2018022312;巴比妥钠、戊巴比妥钠, Sigma公司;乙腈、甲醇, 色谱纯;水为超纯水;其余试剂为分析纯。
 
1.3 实验动物
SPF级昆明种小鼠120只, 体质量 (20±2) g, 雄性, 湖南斯莱克景达实验动物有限公司, 许可证号SCXK (湘) 2016-0002。
 
2 方法和结果
2.1 栀子苷含量的测定[6]
2.1.1 色谱条件
Ulitmate XB-C18色谱柱 (200mm×4.6 mm, 5μm) ;进样量为10μL;以乙腈-水 (12∶88) 为流动相;检测波长为238 nm;体积流量为1 mL/min;柱温为30℃;理论板数按栀子苷峰计算不低于1 500。
 
2.1.2 对照品溶液的制备
精密称取栀子苷对照品8.20 mg, 置50 m L棕色量瓶中, 加甲醇溶解定容至刻度, 摇匀, 即得。
 
2.1.3 供试品溶液的制备
取水提或水提醇沉后干膏粉末 (过四号筛) 约0.1 g, 精密称定, 置50 mL具塞锥形瓶中, 精密加入甲醇25 m L, 称定质量, 超声处理20 min (功率200 W, 频率40 kHz) , 放冷, 再称定质量, 用甲醇补足减失的质量, 摇匀, 滤过。精密量取续滤液5 m L, 置25 m L量瓶中, 加甲醇至刻度, 摇匀, 即得。
 
2.1.4 阴性对照样品溶液的制备
按处方比例栀子-肉桂5∶1, 称取肉桂干膏适量, 按“2.1.3”项方法制成阴性样品溶液。
 
2.1.5 系统适应性试验和专属性试验
分别精密吸取栀子苷对照品溶液、供试品溶液、阴性对照样品溶液各10μL, 注入液相色谱仪, 测定, 色谱图见图1。结果表明栀子苷保留时间为14.513 min, 栀子苷与供试品其他组分分离度良好 (R>1.5) , 阴性对照品无干扰。色谱图见1。
 
2.1.6 栀子苷标准曲线的制备
分别精密吸取“2.1.2”项对照品溶液1、2、4、6、8、10 mL置10m L棕色量瓶中, 加甲醇至刻度, 摇匀, 在“2.1.1”项色谱条件下记录栀子苷峰面积。以色谱峰面积为纵坐标 (Y) , 对照品溶液质量浓度为横坐标 (X) , 绘制标准曲线, 得线性回归方程为Y=16 311 219Ⅹ-47 220, r2=0.999 9, 表明栀子苷在16.40~164.04μg/mL呈良好的线性关系。
 
 图1 栀子苷对照品 (A) 、供试品 (B) 和阴性对照 (C) 溶液的HPLC图Fig.1 HPLC of geniposide reference substance (A) , sample (B) , and negative control (C)
图1 栀子苷对照品 (A) 、供试品 (B) 和阴性对照 (C) 溶液的HPLC图Fig.1 HPLC of geniposide reference substance (A) , sample (B) , and negative control (C)   下载原图
 
2.1.7 精密度试验
取“2.1.2”项对照品溶液, 重复进样6次, 每次精密吸取10μL, 记录栀子苷的峰面积, 并计算RSD值。结果表明, 其RSD为0.14%, 精密度良好。
 
2.1.8 稳定性试验
取供试品溶液分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样, 每次进样10μL, 记录栀子苷的峰面积, 并计算RSD值。结果表明, 其RSD为1.34%, 表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
 
2.1.9重复性试验
精密称取同一批水提浸膏6份, 按照“2.1.3”项方法制备供试品溶液, 每份样品精密吸取10μL进样, 记录栀子苷的峰面积, 计算栀子苷质量分数。结果浸膏中栀子苷平均质量分数为109.79 mg/g, RSD为1.13%, 表明该方法重复性良好。
 
2.1.1 0 加样回收率试验
精密称取6份水提浸膏, 每份0.05 g (已知干膏含量108.78 mg/g) , 分别加入栀子苷对照品溶液 (1.814 4 mg/mL) 3 mL, 按照“2.1.3”项方法制备供试品溶液, 每份样品精密吸取10μL进样, 记录栀子苷的峰面积, 计算加样回收率。结果平均回收率为100.52%, RSD为1.15%。
 
2.1.1 1 样品测定
精密称取单因素及正交试验浸膏样品, 按照“2.1.3”项方法制备供试品溶液, 进样测定。每份样品重复测定2次, 根据线性回归方程, 计算样品中栀子苷含量平均值。
 
2.2 水提工艺优选
2.2.1 水提干膏得率的测定
取适量的肉桂粗粉20 g, 加8倍量水浸泡1 h, 蒸馏5 h, 收集挥发油, 蒸馏后的水溶液滤过另器收集;然后肉桂药渣与栀子 (共120 g) 按照单因素及正交试验安排进行提取, 合并滤液与上述蒸馏液, 精密量取20 mL样品溶液至干燥恒定质量的蒸发皿, 60℃水浴蒸发水分。常压105℃干燥至恒定质量, 置干燥器冷却1 h, 迅速称定质量, 计算得膏率。
 
2.2.2 水提工艺评价指标
通过对栀子功效性成分及药典标志性成分分析, 栀子苷转移率越高, 提取效果越好, 可作为考察提取效果的主要指标, 权重系数为0.6, 同时, 兼顾桂栀助眠方中其他有效成分, 干膏得率作为次要指标, 权重系数为0.4, 因此以干膏得率和栀子苷转移率为评价指标, 对水提工艺进行综合评分。
 
干膏得率=水提液总体积×干膏质量/ (取样体积×原药材质量)
 
水提栀子苷转移率=干膏栀子苷含量×干膏质量/ (原药材栀子苷含量×原药材质量)
 
水提综合评分=干膏得率/最大干膏得率×40+栀子苷含量/最大栀子苷含量×60
 
2.2.3 水提工艺单因素考察
参考相关文献报道[7], 影响水提工艺的主要因素加水量、提取时间、提取次数, 以栀子苷转移率和干膏得率为指标, 分别对每个因素设置5个水平优选出最优的3个水平。
 
(1) 加水量:准确称取药材5份, 每份120 g, 取适量的肉桂粗粉20 g, 加8倍量水浸泡1 h, 蒸馏5 h, 收集挥发油, 蒸馏后的水溶液滤过另器收集, 室温下100 g栀子、肉桂药渣分别加6、8、10、12、14倍量水浸泡0.5 h, 加水煎煮2次, 每次1 h。以考察加水量对干膏得率、栀子苷转移率的影响。由表1可知, 加水量对综合评分影响较大, 随着加水量的增加, 综合评分先升高再降低, 加水量10倍时综合评分最高。结合经济成本, 故选取加水量为6、8、10倍量作为正交试验的3个水平。
 
(2) 提取时间:室温下100 g栀子、肉桂药渣加8倍量水分别浸泡0.5 h, 煎煮2次, 每次分别煎煮0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h, 以考察提取时间对干膏得率、栀子苷含量影响。其余条件同“2.2.3 (1) ”项。由表2可知, 提取时间对挥发油包合物综合评分影响较大, 随着提取时间的增大, 1.0 h时综合评分达最高峰, 大于1.0 h有下降趋势。故选择0.5、1.0、1.5 h 3个水平进入正交试验。
 
(3) 提取次数:室温下100 g栀子、肉桂药渣加8倍量水浸泡0.5 h, 分别加水煎煮1、2、3、4、5次, 每次1 h, 以考察提取次数对干膏得率、栀子苷含量影响。其余条件同“2.2.3 (1) ”项。由表3可知, 提取次数对综合评分影响较大, 随着提取次数的增加, 综合评分显著增加, 当提取次数为2次后, 综合评分增加缓慢, 趋于平稳。考虑企业生产周期、降低生产成本, 故正交试验提取次数选取1、2、3次。
 
表1 加水量对水提效果的影响Table 1 Influence of water addition on water extraction effects     下载原表
 
 表1 加水量对水提效果的影响Table 1 Influence of water addition on water extraction effects
表2 提取时间对水提效果的影响Table 2 Influence of extraction duration on water extraction effects     下载原表
 
 表2 提取时间对水提效果的影响Table 2 Influence of extraction duration on water extraction effects
表3 提取次数对水提效果的影响Table 3 Influence of extraction times on water extraction effects     下载原表
 
 表3 提取次数对水提效果的影响Table 3 Influence of extraction times on water extraction effects
2.2.4 正交试验优选最佳水提工艺
在单因素考察的基础上, 以得膏率、栀子苷转移率为评价指标, 选定加水量 (A) 、提取时间 (B) 、提取次数 (C) 为考察因素, 采用L9 (34) 表进行正交试验, 优选出最佳的提取工艺。见表4、5。
 
由正交试验直观分析表明, 3个主要因素对药材水提效果的影响程度依次是C (提取次数) >A (加水量) >B (提取时间) , 各因素不同水平程度依次是A3>A2>A1、B2>B1>B3、C3>C2>C1, 再通过方差分析表进一步分析, C (提取次数) 对药材水提效果有统计学差异 (P<0.05) 。而A (加水量) 和B (提取时间) 对药材水提效果没有统计学差异 (P>0.05) 。综合评分表明最佳水提工艺为A3B1C3, 即加10倍量水煎煮3次, 每次0.5 h。
 
表4 水提工艺正交试验结果Table 4 Orthogonal experiment result of water extraction technologies     下载原表
 
 表4 水提工艺正交试验结果Table 4 Orthogonal experiment result of water extraction technologies
表5 水提工艺方差分析Table 5 Variance analysis of water extraction technologies     下载原表
 
 表5 水提工艺方差分析Table 5 Variance analysis of water extraction technologies
F0.05 (2, 2) =19.00 F0.01 (2, 2) =99.00
 
2.2.5 验证试验
按照处方比例, 称取药材120 g (栀子100 g、肉桂20 g) , 即称取肉桂粗粉20 g, 加8倍量水浸泡1 h, 蒸馏5 h, 收集挥发油, 蒸馏后的水溶液滤过另器收集, 栀子及肉桂药渣加10倍量水浸泡0.5 h, 加水煎煮3次, 每次0.5 h, 合并滤液与上述蒸馏液, 浓缩至相对密度为1.08~1.10 (60℃) , 真空干燥 (0.08~0.10 MPa, 80℃) 成干浸膏。进行3次重复试验, 测得得膏率平均值为29.67%, RSD为1.57%;栀子苷转移率平均值为68.14%, RSD为3.31%。结果 (表6) 表明验证试验结果和正交试验综合评分最大值相当, 说明该水提工艺稳定、可靠。
 
2.3 醇沉工艺
2.3.1 醇沉干膏得率的测定
按照优选的最佳水提工艺, 按照正交试验安排进行醇沉, 抽滤, 滤液减压浓缩 (50℃) 至适量, 精密量取10 m L样品溶液至干燥恒定质量的蒸发皿, 真空 (0.08~0.10MPa, 105℃) 干燥至恒定质量, 置干燥器冷却1 h, 迅速称定质量, 计算得膏率。
 
表6 水提工艺验证试验结果Table 6 Verification test of water extraction technologies     下载原表
 
 表6 水提工艺验证试验结果Table 6 Verification test of water extraction technologies
2.3.2 醇沉工艺评价指标
考虑到中药水提液杂质较多, 为降低出膏率, 减少患者的服用量, 提高制剂稳定性, 以干膏得率 (权重系数占0.40) 、栀子苷转移率 (权重系数占0.60) 为评价指标, 对醇沉工艺进行综合评分。
 
干膏得率=醇沉液总体积×干膏质量/ (取样体积×原药材质量)
 
醇沉栀子苷转移率=干膏栀子苷含量×干膏质量/ (原药材栀子苷含量×原药材质量)
 
醇沉工艺综合评分=最小干膏得率/干膏得率×40+栀子苷含量/最大栀子苷含量×60
 
2.3.3 醇沉精制工艺优选[8,9]
(1) 正交试验优选最佳工艺:经前期试验研究, 以得膏率、栀子苷转移率为评价指标, 影响醇沉效果因素主要有药液质量浓度 (A) 、药液含醇量 (B) 、醇沉时间 (C) , 称等量的9份药材 (栀子100 g、肉桂20 g) , 按最佳水提工艺制备药液, 采用L9 (34) 正交表进行试验及方差分析, 优选出最佳醇沉工艺。结果见表7、8。
 
表7 醇沉工艺正交试验结果Table 7 Orthogonal experiment result of alcohol precipitation     下载原表
 
 表7 醇沉工艺正交试验结果Table 7 Orthogonal experiment result of alcohol precipitation
表8 醇沉工艺方差分析Table 8 Variance analysis of alcohol precipitation     下载原表
 
 表8 醇沉工艺方差分析Table 8 Variance analysis of alcohol precipitation
F0.05 (2, 2) =19.00 F0.01 (2, 2) =99.00
 
由正交试验直观分析表明, 3个主要因素对药材醇沉效果的影响程度依次是B (药液含醇量) >A (药液质量浓度) >C (醇沉时间) , 各因素不同水平程度依次是A1>A2>A3, B3>B2>B1, C1>C2>C3, 再通过方差分析表进一步分析, A (药液质量浓度) 、B (药液含醇量) 、C (醇沉时间) 对醇沉效果没有显著性影响 (P>0.05) 。综合评分表明最佳醇沉工艺为A2B3C1, 即水提滤液浓缩至1 m L药液相当于原药材1 g, 药液含醇量为80%, 醇沉时间为12 h。
 
(2) 验证试验:按照处方比例, 称取药材120 g (栀子100 g、肉桂20 g) , 即称取肉桂粗粉20 g, 加8倍量水浸泡1 h, 蒸馏5 h, 收集挥发油, 蒸馏后的水溶液滤过另器收集, 按照上述优选的最佳水提工艺制备水提液, 滤过, 合并滤液与上述蒸馏液, 浓缩至1 mL药液相当于原药材1 g, 加入乙醇至含醇量为80%, 静止12 h, 抽滤, 滤液减压浓缩 (-0.08MPa, 50℃) 至相对密度为1.20~1.25 (60℃) , 真空干燥 (80℃) 成干浸膏。进行3次重复试验, 测得得膏率平均值为13.22%, RSD为2.20%;栀子苷转移率为60.14%, RSD为1.66%。说明此醇沉工艺稳定、可靠。见表9。
 
2.4 药效学实验筛选最佳提取工艺
2.4.1 实验药物制备
(1) 栀子-肉桂水提物制备:以上2味药, 称取肉桂50 g、栀子250 g, 按照最优水提工艺制备栀子-肉桂水提物 (棕色至红棕色粉末, 1 g药粉相当于原生药3.37 g) , 粉碎成细粉, 过80目, 备用;使用前将肉桂挥发油混入药粉, 置4℃冰箱备用。
 
表9 醇沉工艺验证试验结果Table 9 Verification test of alcohol precipitation     下载原表
 
 表9 醇沉工艺验证试验结果Table 9 Verification test of alcohol precipitation
(2) 栀子-肉桂水提醇沉提取物制备:以上2味药, 称取肉桂50 g, 栀子250 g, 按照最优水提醇沉工艺制备栀子-肉桂水提醇沉提取物 (棕色至红棕色粉末, 1 g药粉相当于原生药7.56 g) , 其余条件同“2.4.1 (1) ”项。
 
2.4.2 改善睡眠功能评价方法[10]
(1) 直接睡眠实验与延长戊巴比妥钠睡眠时间实验:选取昆明种小鼠40只, 随机分为4组, 设阴性对照组 (生理盐水) 、西药阳性对照组 (地西泮1.51 mg/kg) 、栀子-肉桂水提物组0.59 g/kg (生药量剂量为2.00 g/kg) 、栀子-肉桂水提醇沉物组0.26g/kg (生药量剂量为2.00 g/kg) , 每组10只, 各组小鼠每天ig 10 mL/ (kg·d) , 连续30 d。第29天给小鼠ig 60 min后, 以动物的翻正反射消失超过30~60 s判为进入睡眠, 翻正反射恢复即为动物觉醒, 观察各组小鼠给予受试物入睡动物数;第30天, ig15 min后, 给各组小鼠ip戊巴比妥钠42 mg/kg, 注射量为10 mL/kg, 以翻正反射消失1 min为指标, 观察受试样品能否延长小鼠戊巴比妥钠睡眠时间。
 
(2) 戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验:受试样品给予时间设计同“2.4.2 (1) ”项, 小鼠末次ig 15 min后, 给各组小鼠ip戊巴比妥钠最大阈下剂量32mg/kg, 注射量10 mL/kg, 记录30 min内各组入睡动物数 (翻正反射消失达1 min以上者) 。
 
(3) 巴比妥钠睡眠潜伏期实验:剂量分组及受试样品给予时间设计同“2.4.2 (1) ”项, 小鼠末次ig 15 min后, 给各组小鼠ip巴比妥钠, 剂量280mg/kg, 注射量10 m L/kg, 以翻正反射消失1 min为指标, 观察受试样品对巴比妥钠睡眠潜伏期的影响。
 
(4) 统计方法:采用SPSS 22.0进行统计分析, 直接睡眠小鼠入睡率和戊巴比妥钠阈下剂量入睡率为计数资料, 采用χ2检验;其余指标为计量资料, 实验数据采用 表示, 组间采用单因素方差分析, 方差齐性组间进行LSD检验, 方差不齐者采用Tamhane’s T2检验。
 
2.4.3 结果
(1) 对小鼠体质量的影响:结果 (表10) 表明, 在延长戊巴比妥钠睡眠时间实验、戊巴比妥钠阈下剂量实验、巴比妥钠睡眠潜伏期实验中, 与阴性对照组相比给药组小鼠体质量无明显差异 (P>0.05) , 表明不同提取工艺对小鼠的体质量无明显影响。
 
(2) 对小鼠直接睡眠的影响:结果 (表11) 表明, 各组动物在1 h内均未出现睡眠现象, 表明GSC不同提取物无明显直接催眠作用, 可通过其他3项实验确定进行筛选最佳提取工艺。
 
表1 0 GSC不同提取物对小鼠体质量的影响 Table 10 Effects of GSC different extracts on mice body mass      下载原表
 
 表1 0 GSC不同提取物对小鼠体质量的影响 Table 10 Effects of GSC different extracts on mice body mass
表1 1 GSC不同提取物对小鼠直接睡眠的影响 Table 11 Effects of GSC different extracts on mice direct sleep      下载原表
 
 表1 1 GSC不同提取物对小鼠直接睡眠的影响 Table 11 Effects of GSC different extracts on mice direct sleep
(3) 延长戊巴比妥钠睡眠实验:结果 (表12) 表明, 与阴性对照组相比, GSC水提取物组、地西泮组能延长戊巴比妥钠小鼠睡眠时间 (P<0.01) ;水提醇沉提取物组对小鼠的睡眠时间有延长趋势, 但无显著性差异 (P>0.05) ;经两两比较, 水提取物组延长戊巴比妥钠小鼠睡眠时间效果优于水提醇沉提取物组, 差异显著 (P<0.01) 。
 
(4) 戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验:结果 (表13) 表明, 与阴性对照组相比, GSC水提取物组、地西泮组能增加戊巴比妥钠阈下剂量小鼠入睡率 (P<0.05、0.01) ;经两两比较, 水提取物组提高戊巴比妥钠阈下剂量小鼠入睡率, 效果优于水提醇沉提取物组, 但差异无显著性 (P>0.05) 。
 
表1 2 GSC不同提取物对戊巴比妥钠睡眠时间的影响 Table 12 Effects of GSC different extracts on pentobarbital sodium sleep time      下载原表
 
 表1 2 GSC不同提取物对戊巴比妥钠睡眠时间的影响 Table 12 Effects of GSC different extracts on pentobarbital sodium sleep time
与阴性对照组比较:*P<0.05**P<0.01;与水提物组比较:##P<0.01, 下同*P<0.05**P<0.01 vs negative control group;##P<0.01 vs water extract, same as below
 
表1 3 GSC不同提取物对戊巴比妥钠阈下剂量入睡率的影响 Table 13 Effects of GSC different extracts on sleep rate of sodium pentobarbital subthreshold dose      下载原表
 
 表1 3 GSC不同提取物对戊巴比妥钠阈下剂量入睡率的影响 Table 13 Effects of GSC different extracts on sleep rate of sodium pentobarbital subthreshold dose
(5) 巴比妥钠睡眠潜伏期实验:结果 (表14) 表明, 与阴性对照组相比, 地西泮组能明显缩短巴比妥钠小鼠睡眠潜伏期 (P<0.01) ;其余各组结果差异无显著性 (P>0.05) ;经两两比较, 水提醇沉提取物组与水提取物组缩短巴比妥钠小鼠睡眠潜伏期差异不大, 差异无显著性 (P>0.05) 。
 
3 讨论
中药复方制剂的临床疗效是由方中各味药物协同发挥作用的结果, 因此一般以有效成分及干膏得率加权综合评分, 反映整体提取效果[11], 在水提工艺实验中, 栀子苷转移率越高, 提取效果越好, 可作为考察提取效果的主要指标, 权重系数占0.6, 同时, 兼顾干膏得率, 作为次要指标, 权重系数分别为0.4。在醇沉工艺中, 为方便制剂, 试验中尽可能保留有效成分, 尽可能除去无效成分[12], 因此希望干膏得率越低越好, 栀子苷转移率越高越好, 但有效成分的转移率应占主导地位, 所以本实验得膏率评分为最小干膏得率/干膏得率, 权重系数分别为0.4, 栀子苷转移率权重系数占0.6。
 
表1 4 GSC不同提取物对巴比妥钠睡眠潜伏期的影响 Table 14 Effects of GSC different extracts on barbital sodium sleeping incubation period      下载原表
 
 表1 4 GSC不同提取物对巴比妥钠睡眠潜伏期的影响 Table 14 Effects of GSC different extracts on barbital sodium sleeping incubation period
    下载原表
 
 表1 4 GSC不同提取物对巴比妥钠睡眠潜伏期的影响 Table 14 Effects of GSC different extracts on barbital sodium sleeping incubation period
本实验曾参考相关文献报道[13,14,15,16], 以不同比例的乙腈-水 (15∶85、12∶88、10∶90) 为流动相、甲醇-水 (20∶80) 测定干浸膏中栀子苷的含量, 结果以乙腈-水 (12∶88) 为流动相等度洗脱, 分离效果及峰形最佳, 保留时间适中, 经过多次重复试验, 其分离效果和保留时间稳定, 最终确定以乙腈-水 (12∶88) 为流动相。
 
肉桂挥发油是肉桂传统功效“补火助阳, 引火归元”的主要药效物质基础[17], 因此, 其挥发油可作为肉桂质量标志物的首要选择, 前期课题组以挥发油提取率为指标, 考察浸泡时间、加水量、提取时间3个因素, 优选出挥发油最佳提取工艺, 故本实验制剂工艺设计先通过水蒸气蒸馏法收集肉桂挥发油, 再进一步进行GSC水提醇沉工艺优选, 以保证药效学筛选制剂工艺的合理性。
 
以往制剂工艺研究中, 往往局限于选取一个指标或者多个指标为考察指标, 优选出最佳提取工艺[18,19], 为避免以化学成分为指标造成评价的片面性和局限性, 本实验采取指标成分和药效学结合优选出GSC的提取工艺, 结果表明, GSC水提物在药效强度上更优于水提醇沉提取物, 分析原因如下:其一, 中药水提物更能够体现中医药特色, 能够最大限度地保留水煎剂的有效成分。其二, 水提醇沉提取物虽然能够富集有效成分, 除去杂质, 减少服用量, 但也可能除去引起协同作用的有效成分, 使其药效降低。
 
本研究表明, ig给予小鼠不同受试物30 d, GSC水提取组和水提醇沉物组小鼠在60 min内, 均未有直接睡眠现象;与阴性对照组比较, 水提取物组能延长戊巴比妥钠小鼠睡眠时间, 且能增加戊巴比妥钠阈下剂量小鼠入睡率 (P<0.05) ;水提取物组、水提醇沉组均有缩短巴比妥钠小鼠睡眠潜伏期的趋势, 但无显著性差异 (P>0.05) 。故醇沉前后提取物药效存在差异, 为不影响药效, 最终选择水提工艺作为制剂的最佳提取工艺。

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文章名称:正交设计结合药效学实验优选桂栀助眠胶囊提取工艺研究

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