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蟾酥中蟾毒配基类成分的提取纯化工艺研究

分类:(四) 发表时间:2019-08-20

蟾酥为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor或黑眶蟾蜍Bufo melanostictus Schneider的耳后及皮肤腺分泌的白色浆液, 经加工干燥制成, 是我国常用的一味传统名贵中药。其性温、味辛
蟾酥为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor或黑眶蟾蜍Bufo melanostictus Schneider的耳后及皮肤腺分泌的白色浆液, 经加工干燥制成, 是我国常用的一味传统名贵中药。其性温、味辛, 有毒, 具有解毒、消肿、止痛、开窍醒神之功效[1,2,3,4,5]。近10余年来, 对于蟾酥有效成分的研究不断深入, 现代药学和临床医学研究显示蟾酥对肝癌、肺癌、胃癌、肠癌等多种恶性肿瘤均有非常好的疗效[6,7,8,9]。蟾酥中抗肿瘤活性成分主要为蟾毒配基类和吲哚生物碱类[10,11], 其中蟾毒配基类主要包含华蟾酥毒基、脂蟾毒配基等成分, 关于其化学性质和药理作用已进行了很多研究。
 
星点设计属于多因素5水平的试验设计, 模型的预测性好, 并可通过三维效应面直观分析最优条件[12,13]。因此本研究选择华蟾酥毒基和脂蟾毒配基2种蟾毒配基总量为指标成分, 通过正交试验优化蟾毒配基的提取工艺, 以Box-Benhnken响应面分析法优化华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的纯化工艺, 旨在为其制剂工艺或质量安全等方面提供参考, 为后续制剂发展与研究奠定基础, 具有一定的应用价值。
 
1 仪器与试药
1.1 仪器
Agilent-1260高效液相色谱仪, 美国安捷伦科技有限公司;CP2250分析天平, 奥豪斯国际贸易有限公司;KQ-500E型超声波清洗器, 昆山市超声仪器有限公司;0.22μm微孔滤膜, 天津市色谱科学技术公司。
 
1.2 试药
对照品华蟾酥毒基 (批号W16M9Z56140) 、脂蟾毒配基 (批号C30S8G45143) , 质量分数均≥98%, 上海源叶生物科技有限公司;蟾酥, 购自山东中医药大学附属医院, 经山东中医药大学附属医院张学顺主任药师鉴定为中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor耳后腺和皮肤腺分泌的白色浆液加工、干燥而成;柱色谱用硅胶, 200~300目, 青岛海洋化工有限公司;甲醇、乙腈均为色谱纯, 美国Tedia试剂公司;实验用水为娃哈哈纯净水, 其余化学试剂均为分析纯。
 
2 方法与结果
2.1 华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的HPLC定量测定
2.1.1色谱条件[14,15]
色谱柱为Eclipse Plus C18柱 (250 mm×460 mm, 5μm) ;以乙腈-0.5%磷酸二氢钾 (50∶50, 用磷酸调节pH值3.2) 为流动相;检测波长296 nm;柱温26℃;体积流量1.0 mL/min;进样量20μL;理论板数按华蟾酥毒基峰、脂蟾毒配基峰计算均不低于4 000。
 
2.1.2 对照品溶液的制备
精密称取华蟾酥毒基2.84 mg、脂蟾毒配基2.80 mg, 加甲醇定容至25 mL量瓶中, 分别制成质量浓度为113.6、112.0μg/mL的混合对照品溶液。
 
2.1.3 供试品溶液的制备
称取蟾酥原药材中粉适量, 按照实验设计的方法进行提取、纯化、干燥。精密称取提取纯化干燥后粉末5.34 mg置于10 m L量瓶中, 甲醇溶解并定容, 称定质量, 超声至溶解, 放冷, 补足减失的质量, 摇匀, 用0.22μm微孔滤膜滤过, 作为供试品溶液。
 
2.1.4 专属性考察
分别精密量取甲醇溶液、混合对照品溶液、供试品溶液各20μL, 按“2.1.1”项下色谱条件测定, 华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的保留时间分别为8.3、9.7 min, 阴性无杂质峰干扰, 专属性好。结果见图1。
 
 图1 空白液 (A) 、混合对照品溶液 (B) 和供试品溶液 (C) 的HPLC图Fig.1 HPLC of blank solution (A) , mixed reference substances solution (B) , and solution for test products (C)
图1 空白液 (A) 、混合对照品溶液 (B) 和供试品溶液 (C) 的HPLC图Fig.1 HPLC of blank solution (A) , mixed reference substances solution (B) , and solution for test products (C)   下载原图
 
2.1.5 线性关系考察
精密吸取混合对照品溶液1、2、4、6、8、10 m L于10 m L量瓶中, 加甲醇至刻度, 制成一系列质量浓度的对照品溶液。精密吸取上述溶液分别进样, 以峰面积 (Y) 对质量浓度 (X) 进行线性回归, 求得线性回归方程为华蟾酥毒基Y=14.13 X+13.442, r2=0.999 8, 脂蟾毒配基Y=15.466 X-2.646 6, r2=0.999 8。结果表明华蟾酥毒基在11.36~113.60μg/mL、脂蟾毒配基在11.20~112.00μg/mL线性关系良好。
 
2.1.6 精密度试验
精密吸取“2.1.2”项下混合对照品溶液20μL, 按“2.1.1”项下色谱条件, 连续进样6次, 测定峰面积, 所测得的华蟾酥毒基峰面积的RSD为0.14% (n=6) , 脂蟾毒配基对照品相应峰面积的RSD为0.20% (n=6) , 表明仪器精密度良好。
 
2.1.7 稳定性试验
精密吸取“2.1.3”项下的供试品溶液20μL, 在0、2、4、6、8、12、24 h分别进样测定, 结果供试品溶液中华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的RSD分别为0.46%、0.33%, 结果表明供试品溶液在至少24 h内稳定性良好。
 
2.1.8 重复性试验
精密称取6份同一蟾酥提取纯化物样品, 每份4.75 mg, 按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液, 按“2.1.1”项下色谱条件测定, 计算华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的RSD分别为1.21%, 0.92%, 表明方法重复性良好。
 
2.1.9 加样回收率试验
精密称取6份已测定的蟾酥纯化物粉末, 每份0.10 mg, 分别精密加入与样品中含有量相当的华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的对照品, 按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液, 按“2.1.1”项下色谱条件测定, 结果华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的平均加样回收率为98.92%~101.05%, RSD分别为1.37%、1.03%, 结果表明, 此色谱条件下2种蟾毒配基成分的加样回收率符合方法学要求。
 
2.2 单因素实验考察蟾毒配基提取工艺
影响加热回流提取工艺的主要因素有乙醇体积分数、溶剂倍数、提取时间和提取次数等[16,17], 本研究以华蟾酥毒基和脂蟾毒配基总量作为考察指标, 分别选取乙醇体积分数、溶剂倍数、提取时间、提取次数4个因素, 分别考察其对提取工艺的影响。
 
2.2.1乙醇体积分数考察
称取蟾酥原料药中粉20 mg, 分别加入10倍量不同体积分数 (65%、75%、85%、95%、100%) 的乙醇, 提取2次, 每次1 h, 合并提取液, 按“2.1”项下方法测定, 分别计算华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的总量。结果分别为9.41%、10.29%、11.55%、11.32%、11.26%。
 
2.2.2 溶剂倍数考察
称取蟾酥原料药中粉20mg, 分别加入不同倍量 (6、8、10、12、15) 体积分数为85%的乙醇, 提取2次, 每次1 h, 合并提取液, 按“2.1”项下方法测定, 分别计算华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的总量。结果分别为9.59%、10.32%、11.61%、11.65%、11.50%。结果显示, 10倍量乙醇基本将蟾毒配基提取完全, 12倍量与10倍量乙醇相比, 差距不明显。
 
2.2.3 提取时间考察
称取蟾酥原料药中粉20mg, 分别加入10倍量体积分数为85%的乙醇, 提取2次, 时间分别为0.5、1.0、1.5、2.0 h, 合并提取液, 按“2.1”项下方法测定, 分别计算华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的总量。结果分别为10.03%、11.72%、12.79%、12.84%。
 
2.2.4 提取次数考察
称取蟾酥原料药中粉20mg, 分别加入10倍量体积分数为85%的乙醇, 提取不同次数 (1、2、3) , 每次1 h, 测定华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的总量分别为11.68%、12.91%、13.06%。结果显示, 提取2次比提取1次含量显著提高, 提取3次与提取2次相比, 含量提高并不显著, 从节约经济成本和时间的角度考虑, 将提取次数定为2次。
 
2.3 正交试验优化蟾毒配基提取工艺
根据单因素实验考察结果, 选取乙醇体积分数 (A) 、溶剂倍数 (B) 、提取时间 (C) 3种因素作为自变量, 以华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的总量作为因变量。在平行操作条件下, 按L9 (34) 正交表进行试验, 优选蟾酥醇提最佳工艺条件, 试验设计及分析结果见表1、2。根据表1、2结果分析可知, A、B、C 3个因素对蟾酥提取工艺的影响大小即为A>C>B, 即乙醇体积分数影响最大, 其次是提取时间, 而料液比的影响最小, 即最佳醇提工艺为A2B2C3, 方差分析表明乙醇体积分数对试验结果具有显著影响 (P<0.05) , 其他3个因素对结果影响不显著, 考虑到工业化实际生产, 节约经济成本, 选择工艺为A2B1C3, 即加入10倍量85%的乙醇, 提取90 min。
 
2.4 单因素考察蟾毒配基的纯化工艺
参考文献报道可知[18,19], 展开剂比例、柱高与直径比、上样量、体积流量对硅胶柱色谱纯化工艺有很大影响。本实验选取主要影响纯化工艺结果的展开剂比例 (A) 、柱高与直径比 (B) 、硅胶量 (C) 为考察因素, 通过单因素考察并结合Box-Behnken响应面法, 优选出蟾毒配基的最佳纯化工艺。
 
2.4.1 洗脱剂比例对纯化工艺的影响
参照《中国药典》2015年版选取环己烷-氯仿-丙酮作为洗脱剂, 取硅胶5份, 湿法装柱, 柱高与直径比2∶12, 按照吸附剂与上样量比为5∶1称取拌样硅胶, 干法上样, 以环己烷-氯仿-丙酮4∶3∶1、4∶3∶2、4∶3∶3、4∶3∶4、4∶3∶5分别进行洗脱, 洗脱体积流量为2.5 mL/min, 收集洗脱液, 蒸干, 测定华蟾酥毒基和脂蟾毒配基总量分别为49.32%、54.71%、57.33%、55.85%、50.82%。结果表明, 当丙酮用量逐渐增加时, 测得的华蟾酥毒基和脂蟾毒配基总量是升高的, 但丙酮的用量超过一定比例时, 蟾毒配基总量会有所降低。
 
表1 正交试验设计与结果Table 1 Orthogonal test arrangement and results     下载原表
 
 表1 正交试验设计与结果Table 1 Orthogonal test arrangement and results
表2 方差分析Table 2 Variance analysis     下载原表
 
 表2 方差分析Table 2 Variance analysis
F0.05 (2, 2) =19.00 F0.01 (2, 2) =99.00
 
2.4.2 柱高与直径比对纯化工艺的影响
取硅胶5份, 湿法装柱, 柱高与直径比分别为4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1。按吸附剂与上样量的比值为5∶1称取拌样硅胶, 干法上样, 以环己烷-氯仿-丙酮 (4∶3∶3) 洗脱, 洗脱体积流量为2.5 mL/min, 收集洗脱液, 蒸干, 测定华蟾酥毒基和脂蟾毒配基总量分别为55.32%、57.71%、60.55%、63.85%、64.02%。结果表明, 柱高与直径比越大, 相当于理论塔板数越高, 华蟾酥毒基和脂蟾毒配基被吸附、解析的次数越多, 测得的华蟾酥毒基和脂蟾毒配基总量是逐渐升高的, 分离效果越好。但柱高与直径比过大会造成溶剂耗费增加, 且耗时长, 因此考虑到综合消费比及实际生产问题, 选择柱高与直径比为7∶1的柱子进行洗脱。
 
2.4.3 上样量对纯化工艺的影响
取硅胶5份, 湿法装柱, 柱高与直径比为2∶14。按吸附剂与上样量的比值为3∶1、5∶1、7∶1、9∶1、11∶1, 称取拌样硅胶, 干法上样。以环己烷-氯仿-丙酮 (4∶3∶3) 洗脱, 洗脱体积流量为2.5 mL/min, 收集洗脱液, 蒸干, 甲醇定容, 测定华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的总量分别为57.13%、63.26%、65.64%、63.94%、60.34%。结果表明, 不同的上样量, 通过硅胶柱色谱所得的华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的纯化产物总量不同, 当上样量与吸附剂的比值为3∶1~7∶1时, 测定华蟾酥毒基和脂蟾毒配基总量显著增加, 但吸附剂与上样量比值超过7∶1时, 测得蟾毒配基总量有所降低。
 
2.5 Box-Behnken设计优化蟾毒配基的纯化工艺
在单因素实验基础上, 以展开剂比例 (丙酮占环己烷-氯仿-丙酮体系的比例, A) 、柱高与直径比 (B) 、吸附剂与上样量的比值 (C) 作为自变量, 采用Box-Behnken响应面法设计对蟾酥中蟾毒配基纯化工艺进行优化, 以华蟾酥毒基和脂蟾毒配基总量为响应值, 并绘制二维等高线图和三维效应面图。通过回归方程分析各工艺参数与响应值之间的关系, 并由此预测最佳的纯化工艺条件。Box-Behnken试验因素水平设计见表3, Box-Behnken试验设计及结果见表3, 分析及回归模型系数显著性检验结果见表4。
 
2.5.1 Box-Behnken试验结果分析
利用Design Expert 8.0软件对表3的试验结果进行二次多元回归拟合, 得二次多项回归模型方程Y=66.32+0.46A-0.31 B+1.19 C+1.14 AB+1.00 AC+0.22 BC-2.58 A2-2.67 B2-2.47 C2, r2=0.985 2。模型的R2接近于1, 说明通过二次回归得到的模型与试验拟合较好。同时, 响应面二次回归方程方差分析结果显示, 模型F=51.67, P<0.000 1, 表示采用的二次模型具有极显著性差异, 预测性高[20,21]。失拟项P=0.106 9 (P>0.05) , 不显著, 因此二次模型成立。
 
2.5.2影响蟾酥纯化的主要因素分析
蟾毒配基总量模型 (Y) 回归方程的方差分析表明, C、AB、AC、A2、B2、C2项达极显著水平 (P<0.01) , A项达显著水平 (P<0.05) , B项和BC和的P分别为0.118 4和0.418 9, 均大于0.05, 所以B项和BC项对纯化华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的工艺没有显著性影响。由F值大小可以推断, 在所选择的实验范围内, 3个因素对蟾酥纯化工艺影响的排序为吸附剂与上样量的比值 (C) >展开剂比例 (A) >柱高与直径比 (B) , 响应面所对应的二维等高线图及三维效应图分别见图2。
 
表3 蟾毒配基纯化工艺优化Box-Behnken试验设计与结果Table 3 Design and results of optimized Box-Behnken test for purification process of toad venom ligand     下载原表
 
 表3 蟾毒配基纯化工艺优化Box-Behnken试验设计与结果Table 3 Design and results of optimized Box-Behnken test for purification process of toad venom ligand
表4 分析及回归模型系数显著性检验结果Table 4 Analysis and regression model coefficient significant test results     下载原表
 
 表4 分析及回归模型系数显著性检验结果Table 4 Analysis and regression model coefficient significant test results
2.5.3 响应面预测与工艺验证
应用Design-Expert8.0软件设计考察指标华蟾酥毒基和脂蟾毒配基总量 (Y) 最大, 经软件优化后得到的最佳纯化工艺为丙酮所占比例为3.14, 柱高与直径比为6.98, 吸附剂与上样量的比为5.53。综合考虑到实际生产条件需要, 确定最佳工艺为环己烷-氯仿-丙酮4∶3∶3、柱高与直径比为7∶1, 吸附剂与上样量比值为5.5∶1。为了进一步验证纯化工艺稳定性和可行性, 按上述最佳条件进行3次验证试验, 具体结果见表5。由结果可知测定值与预测值接近, RSD为0.98%, 表明模型合理可靠, 预测性好, 可以采用此工艺对华蟾酥毒基和脂蟾毒配基。
 
3 讨论
本研究采用HPLC法对华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量进行测定, 在色谱条件中柱温选择26℃, 而《中国药典》2015年版规定柱温为40℃。经过前期的多次预试验, 柱温设定40℃的条件下, 色谱峰之间分离度不好, 且杂峰较多。经过多次摸索, 最终选择柱温为26℃实验条件下, 华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的色谱峰分离度较好, 且峰形良好。
 
华蟾酥毒基和脂蟾毒配基成分属于脂溶性物质难溶于水, 可溶于有机溶剂, 预试验中考察不同提取溶剂 (甲醇、乙醇) 和提取方法 (加热回流提取、超声波提取、浸提法) , 结果乙醇为提取溶剂进行加热回流提取效果最佳。另外, 药材经过多次提取之后所得含量逐渐减少, 一般2~3次, 考虑到实际生产及经济成本, 选择提取2次为宜。因此, 本实验固定对蟾酥原料药提取2次, 确定影响提取华蟾酥毒基和脂蟾毒配基总量的考察因素分别为乙醇体积分数、溶剂倍量和提取时间, 以提取液中华蟾毒配基和脂蟾毒配基总量为指标进行正交试验, 最终确定最佳提取工艺为A2B1C3, 即加入10倍量85%的乙醇, 提取时间为90 min。本实验结果表明乙醇体积分数对蟾酥成分的提取率具有较明显的影响, 这为蟾酥酒炮制工艺的深入系统研究提供依据和良好的实验基础。
 
 图2 蟾毒配基纯化工艺优化三维响应面图和二维等高线图Fig.2 Optimization of three-dimensional response surface and contour plots for purification process of toad poison ligand
图2 蟾毒配基纯化工艺优化三维响应面图和二维等高线图Fig.2 Optimization of three-dimensional response surface and contour plots for purification process of toad poison ligand   下载原图
 
表5 验证试验结果 (n=3) Table 5 Validation test results (n=3)     下载原表
 
 表5 验证试验结果 (n=3) Table 5 Validation test results (n=3)
蟾酥经醇提所得的醇提液成分复杂、杂质较多, 而蟾酥中华蟾酥毒基基和脂蟾毒配基毒基含量则相对较低, 因此对蟾酥提取液中有效成分进行纯化尤为关键[19]。本研究采用Box-Behnken响应面法, 对蟾酥中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的硅胶柱色谱纯化工艺进行优化, 得到最优工艺:环己烷-氯仿-丙酮4∶3∶3、柱高与直径比为7∶1, 吸附剂-上样量为5.5∶1, 华蟾酥毒基和脂蟾毒配基总量为66.30%, 与预测值66.51%接近, 表明模型拟合度良好。并且采用硅胶柱色谱分离纯化脂蟾毒配基, 具有操作简便、分离速度快、分离效果好、封闭操作有机溶剂挥发少等优点, 易于实现工业化生产[21]。

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文章名称:蟾酥中蟾毒配基类成分的提取纯化工艺研究

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