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pH敏感电荷反转型姜黄素纳米粒子的制备及体外评价

分类:(四) 发表时间:2019-08-20

姜黄素 (curcumin, Cur) 是从天南星科和姜科植物的根茎中提取的多酚类化合物, 中药姜黄中主要有效成分之一。研究表明Cur具有多种药理活性, 如具有很强的镇痛、抗氧化、抗炎、抗败血症
姜黄素 (curcumin, Cur) 是从天南星科和姜科植物的根茎中提取的多酚类化合物, 中药姜黄中主要有效成分之一。研究表明Cur具有多种药理活性, 如具有很强的镇痛、抗氧化、抗炎、抗败血症、抗肿瘤等[1,2,3,4,5,6,7,8,9]。特别是Cur对人体的毒副作用小, 相对于普通化疗药物, Cur能够更特异地杀伤肿瘤细胞。Cur作为一种抗肿瘤药物, 能通过切断某些信号通路阻滞细胞周期或诱导细胞凋亡、抑制肿瘤细胞的侵袭与转移、减缓肿瘤内部的血管生成、影响炎性因子产生等作用来抑制肿瘤的发生[3,10,11,12]。但是Cur的水溶性和稳定性较差, 口服生物利用度较低, 这在很大程度上限制了Cur的临床应用[13,14,15,16]。
 
聚乙二醇-聚己内酯-聚乙烯亚胺 (MPEG-PCL-PEI, PCE) 是由生物相容性好、低毒的聚乙二醇、聚己内酯和聚乙烯亚胺合成的嵌段共聚物, 广泛地应用于药物载体领域, 尤其是纳米粒子、微球等给药系统是近几年的研究热点[17,18]。因此, 本课题以材料PCE为基础键合1, 2-环己二酸酐, 制备了pH敏感电荷反转型Cur纳米粒子 (PCE/Cur NPs) , 为Cur应用于抗癌做出了有意义的探索。
 
1 仪器与材料
JEOL透射电子显微镜 (TEM) , 日本电子株式会社;UV1810S紫外可见分光光度计, 青岛聚创世纪环保科技有限公司;BX53正置荧光显微镜, 上海普赫光电科技有限公司;R-210旋转蒸发仪, 武汉杰思炜科技有限公司;ZEN3600激光粒度分析仪, 英国马尔文仪器有限公司。
 
辛酸亚锡[Sn (Oct) 2]、聚乙亚胺 (PEI) 、Cur, 美国Sigma公司;ε-己内酯 (ε-CL) , 美国Alfa Aesar公司;单甲氧基聚乙二醇 (MPEG) , 相对分子质量为2 000, 美国Fluka公司;1, 2-环己烷二酸酐, 二氯甲烷、石油醚, 成都科龙化工试剂厂;MTT试剂, 分析纯, 上海化学试剂公司;二甲基亚砜 (DMSO) , 分析纯, 上海阿拉丁生化科技有限公司。
 
B16细胞, 湖南丰晖生物科技有限公司。
 
2 方法与结果
2.1 p H敏感电荷翻转型嵌段共聚物PCE的合成
PCE的合成路线[19,20]参考本课题组以前的工艺。PCE带有正电荷, 用1, 2-环己二酸酐 (B) 与PCE嵌段共聚物中的PEI段反应, 将PEI的胺基酰胺化为羧基酰胺, 得到带负电荷的酰胺化PEI。当在酸性环境中, 特别当p H值<6时, 1, 2-环己烷二羧基酰胺基团自催化水解, 重新生成带有正电荷的PCE。合成流程图见图1。
 
2.2 PCE/Cur NPs的制备
称取一定量的Cur与共聚物PCE粉末, 共同溶解于2 m L无水乙醇中, 在55℃恒温水浴中以70r/min的速度旋转蒸发数分钟, 待有机溶剂完全除去后, 加入10 mL经预热的超纯水, 轻微振荡, 可观察到载药纳米胶束溶液形成, 过0.22μm水系滤膜, 收集滤液, 滤液澄清透明, 具有丁达尔现象。PCE/Cur纳米胶束的形成过程如图2所示, 左下部分为制备纳米粒子的材料与药物混合粉末及其制备的纳米粒子溶液。部分用作接下来的各项表征, 部分经真空冷冻干燥至恒定质量后密封保存备用。
 
 图1 p H值敏感电荷翻转型嵌段共聚物PCE的合成流程图Fig.1 Synthetic illustration of p H sensitive charge-reversal polymer PCE
图1 p H值敏感电荷翻转型嵌段共聚物PCE的合成流程图Fig.1 Synthetic illustration of p H sensitive charge-reversal polymer PCE   下载原图
 
 图2 PCE/Cur NPs的制备示意图Fig.2 Illustration of preparation of charge-reversal p H sensitive PCE/Cur NPs
图2 PCE/Cur NPs的制备示意图Fig.2 Illustration of preparation of charge-reversal p H sensitive PCE/Cur NPs   下载原图
 
2.3 PCE/Cur NPs形貌观察
PCE/Cur NPs的形貌使用TEM观察;观察前, 先将PCE/Cur NPs用缓冲溶液 (pH 7.4) 稀释, 滴到铜网上, 然后用磷钨酸负染, 在室温下干燥, 然后观察。如图3所示PCE/Cur NPs大小基本均一, 平均粒径为 (80±5) nm, 基本没有黏连现象。
 
 图3 PCE/Cur NPs的粒径分布 (A) 与TEM图片 (B) Fig 3 Mean particle size distribution (A) and TEM photographs (B) of PCE/Cur NPs
图3 PCE/Cur NPs的粒径分布 (A) 与TEM图片 (B) Fig 3 Mean particle size distribution (A) and TEM photographs (B) of PCE/Cur NPs   下载原图
 
2.4 PCE/Cur NPs的p H值依赖性考察
配制3种缓冲溶液模拟正常组织 (p H 7.4) 、肿瘤细胞内涵体 (pH 6.0) 、溶酶体 (p H 5.0) , 分别考察纳米颗粒在上述不同pH值条件下的电势与粒径随时间的变化, 考察PCE/Cur NPs的电荷反转情况及其粒径。取一定量的PCE/Cur NPs缓冲溶液 (p H7.4) , 电位为 (-30.0±2.5) m V, 粒径为 (80.0±3.5) nm, 分别转移到pH值为7.4、6.0、5.0的缓冲溶液中, 考察PCE/Cur NPs的粒径与电位随时间的变化。如图4所示, 在p H值为7.4的缓冲溶液中, PCE/Cur NPs的电位几乎没发生实质性的变化, 维持在-30 mV, 没有发生电荷翻转, 粒径变化也不大, 分析可知1, 2-环己二酸酐 (B) 在此条件下, 几乎不发生水解。而随着pH值的降低, 酸性增强, 特别是pH值为5的时候, PCE/Cur NPs水解加快, PEI链段上的1, 2-环己二酸酐水解掉, 电荷发生翻转, 带正电, 约为25 mV, 但是在整个过程中, 粒径变化不大, 在70~90 nm, 分析原因可能是亲水性MPEG的有效保护。
 
2.5 PCE/Cur NPs的载药量和包封率的测定
准确称取一定量的冷冻干燥好的PCE/Cur NPs, 加入一定体积的无水乙醇, 超声破坏纳米粒子, 紫外分光光度计于418 nm波长测定其吸光度 (A) 值, 根据标准曲线, 按公式计算载药量和包封率。
 
 图4 在不同pH条件下PCE/Cur NPs的电势与粒径随时间的变化Fig 4 Changes of zeta potential and particle size of PCE/Cur NPs at different pH
图4 在不同pH条件下PCE/Cur NPs的电势与粒径随时间的变化Fig 4 Changes of zeta potential and particle size of PCE/Cur NPs at different pH   下载原图
 
载药量=实测药物含量/ (药物含量+聚合物含量)
 
包封率=实测药物含量/理论药物含量
 
在制备纳米粒子的过程中, 通过调整材料与Cur的比例, 可实现不同的载药量及包封率, 如表1所示, 通过测定不同投料比的PCE/Cur NPs中Cur的含量, 可观察到随着制备过程中Cur投料量的增加, PCE/Cur NPs的实际载药量也相应增加, 而包封率相对会下降, 通过表1综合分析可知, 材料与Cur的投料比为1∶9, PCE/Cur NPs的载药量与包封率为最佳, 分别为 (9.7±0.1) %和 (98.2±0.6) %。
 
表1 PCE/Cur NPs的载药量与包封率Table 1 Drug loading and encapsulation efficiency of PCE/Cur NPs at various weight ratios     下载原表
 
 表1 PCE/Cur NPs的载药量与包封率Table 1 Drug loading and encapsulation efficiency of PCE/Cur NPs at various weight ratios
2.6 PCE/Cur NPs的体外释放
把1 m L PCE/Cur NPs溶液 (Cur质量浓度1mg/mL) 放入透析袋 (截留相对分子质量8 000~10 000) 中, 同时把1 mL Cur的DMSO溶液 (质量浓度1 mg/mL) 也放入透析袋 (截留相对分子质量8 000~10 000) 中作为对照。透析袋分别放入盛有10 mL pH值7.4与5的缓冲溶液的容器中, 放置在37℃的摇床里。在预定时间, 把得到的释放液取出, 放入冰箱中 (-20℃) 待测, 然后补充10 mL的新鲜的预热 (37℃) 缓冲液。利用紫外分光光度法测定Cur的释放度。如图5所示, PCE/Cur NPs有很好的缓控释作用, 在最初几个小时内, 释放较快, 6h内, PCE/Cur NPs累积释放率分别为 (24.7±3.5) % (pH 7.4) 与 (28.8±4.2) % (pH 5.0) , 有利于药物快速起效, 48 h后, PCE/Cur NPs释放趋于恒速, 释放缓慢, 累积释放率达到 (69.2±5.2) % (pH 7.4) 与 (71.2±4.3) % (pH 5.0) , 酸性低, 释放较快, 可能与PCE/Cur NPs水解掉1, 2-环己二酸酐, 降低了Cur的溶出阻力有关。而游离的Cur, 在8 h内, 无论是pH值5.0或7.4累积释放率都达到 (93.1±2.3) %。
 
 图5 PCE/Cur NPs的体外释放 (x±s, n=3) Fig.5 Release profile of PCE/Cur NPs (x±s, n=3)
图5 PCE/Cur NPs的体外释放 (x±s, n=3) Fig.5 Release profile of PCE/Cur NPs (x±s, n=3)   下载原图
 
2.7 PCE/Cur NPs对B16细胞的增殖抑制作用
PCE/Cur NPs的细胞增殖抑制实验通过MTT比色法测定。B16细胞培养在含10%新生牛血清的DMEM培养液中, 放置于37℃、5%CO2的孵箱中生长。待细胞丰度为70%~80%时, 将B16细胞以细胞数为1×104个/孔接种于96孔板, 孵育24 h后, 将不同质量浓度的试样分别加入至96孔板并在37℃培养24 h, 吸弃培养液, 并加入新鲜的无血清DMEM培养基100μL及5 mg/mL MTT溶液10μL, 于37℃孵育4 h, 吸弃培养液, 加入DMSO溶液100μL。以未加入样品的细胞为对照组, 在570 nm处测A值, 计算细胞存活率。
 
细胞存活率= (试样处理细胞的A值-对照组细胞的A值) / (未经过处理组细胞的A值-对照组细胞的A值)
 
PCE/Cur NPs对细胞的增殖抑制作用如图6所示, 各种制剂均对B16显示出了抑制作用, 随着质量浓度的增大, 细胞的增殖抑制作用越明显。可以看出不同的制剂对细胞的抑制作用差别明显, 正电性PCE/Cur NPs对细胞的抑制作用强于负电性PCE/Cur NPs与原料药组, 这可能与细胞表面带负电有关。
 
 图6 PCE/Cur NPs对B16细胞的增殖抑制作用 (x±s, n=3) Fig.6 Inhibitory rates of PCE/Cur NPs on B16 cells at different time points by MTT (x±s, n=3)
图6 PCE/Cur NPs对B16细胞的增殖抑制作用 (x±s, n=3) Fig.6 Inhibitory rates of PCE/Cur NPs on B16 cells at different time points by MTT (x±s, n=3)   下载原图
 
2.8 PCE/Cur NPs对B16细胞侵袭浸润能力的影响
收集处于对数生长期的B16细胞后调整细胞浓度4×104~6×104个/mL后, 接种于24孔板继续培养至细胞长至孔底部面积的80%, 换成含1%FBS的RPMI 1640培养基继续培养12 h, 用无菌200μL移液器枪头在24孔底部划出一条约2 mm宽直线区域, 用无菌1×PBS反复漂洗24孔板以洗脱漂浮的细胞及细胞碎片, 分别加入不同质量浓度 (主药含量计算) 梯度的样品, 未处理组 (A) 、溶剂对照组 (B) 、Cur混悬液8μg/mL (C) 、12μg/mL (D) 、16μg/mL (E) 及PCE/Cur NPs溶液8μg/mL (F) 、12μg/mL (G) 、16μg/mL (H) , 每组设3个复孔, 新鲜的培养基继续培养24 h, 24 h后在倒置显微镜下观察孔内细胞迁移能力变化情况, 结果见图7。
 
迁移率= (原划痕宽度-现划痕宽度) /原划痕宽度
 
从图7中可以发现, PCE/Cur NPs质量浓度在8μg/mL (F) 、12μg/mL (G) 、16μg/mL (H) 时, 细胞的迁移能力得到了明显的抑制。特别是质量浓度在16μg/mL (H) 时, 显著地抑制了B16细胞的迁移能力, 抑制率达到95.50% (P<0.05) , 而质量浓度在8μg/mL (F) 、12μg/mL (G) 时, 抑制率分别为90.30%、86.50% (P<0.05) , 也远远高于Cur混悬液的抑制率, 52.20% (C) 、72.30% (D) 与78.30% (E) (P<0.05) , 未处理组与溶剂组几乎不影响迁移。结果表明PCE/Cur NPs对B16细胞的迁移能力的抑制作用优于原料药, 且呈现良好的量效关系。
 
 图7 PCE/Cur NPs对B16细胞迁移能力的影响Fig.7 Effect of PCE/Cur NPs on migration of B16 cells
图7 PCE/Cur NPs对B16细胞迁移能力的影响Fig.7 Effect of PCE/Cur NPs on migration of B16 cells   下载原图
 
3讨论
 
本实验在原有材料PCE研究的基础上, 通过PEI链段上的氨基, 将PEI的胺基转化为β-羧基酰胺, 得到带负电荷的酰胺化PEI。通过热引发条件下自组装作用, 制备显示负电性的PCE/Cur NPs, 该纳米粒子大小为80 nm左右, 大小均一, 分散性良好。分析原因可能是亲水性柔软链段MPEG的存在及所带电荷, 大大提高了PCE/Cur NPs在正常生理条件下的稳定性 (pH约为7.4左右) , 有效地阻止了纳米粒子的团聚。
 
酰胺键断裂具有环境响应性 (pH依赖性) , 利用肿瘤组织微环境的酸性条件下 (p H值小于6) , 羧基酰胺基团自催化水解, 酰胺键断裂, 重新生成胺基, 使得载体带正电荷。这样就可以使纳米颗粒在正常组织中特别是血液中显负电性, 提高纳米粒子的血液稳定性, 延长纳米粒子在血液中的循环时间。而在肿瘤组织特别是在内涵体或溶酶体的酸性环境中, PCE/Cur NPs水解断裂掉1, 2-环己二酸酐显正电性, 使纳米颗粒在细胞内能够成功地实现电荷翻转为细胞内吞提供了有利条件。
 
载药量与包封率是衡量载体的重要指标, 本实验中, 通过改变投药量, 考察了不同配比制得的PCE/Cur NPs。纳米粒子过220 nm的微孔滤膜, 去除未被包载进入的Cur, 减小游离药物对实验结果的影响。发现材料与Cur的投料比为1∶9时, 两者达到最佳效果。
 
体外释放研究发现, PCE/Cur NPs的释放具有缓控释的特征, 可维持稳定持久的释药浓度, 更好地发挥疗效。PCE/Cur NPs抑制细胞的增殖与侵袭浸润具有浓度依赖性, 但是优于单纯的原料药。分析原因可能是PCE/Cur NPs不但解决了Cur的水不溶性, 同时分散性远远优于原料药, 更有利于细胞摄取, 进入细胞发挥作用。

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