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附子与山茱萸配伍对慢性心力衰竭大鼠的影响

分类:(一) 发表时间:2019-08-19

慢性心力衰竭 (CHF) 是由于多种原因导致的心室泵和 (或) 充盈功能下降的一种临床综合征, 是多种心血管疾病的终末期表现[1]。目前研究认为CHF主要表现为心肌收缩功能和心输出量下降
慢性心力衰竭 (CHF) 是由于多种原因导致的心室泵和 (或) 充盈功能下降的一种临床综合征, 是多种心血管疾病的终末期表现[1]。目前研究认为CHF主要表现为心肌收缩功能和心输出量下降, 机体组织供氧和代谢的血液供应减少。附子作为温通心阳的常用药, 具有增强心肌收缩力和增加心输出量的功能[2], 但附子大毒, 临床主要表现为心脏毒性, 如心律失常等。传统医学认为, 附子味辛, 甘, 性热走窜;山茱萸味酸, 善酸敛收涩。附子辛而能散, 山茱萸酸而能敛, 两者常配伍用于强心。本实验研究附子与山茱萸配伍前后对CHF大鼠模型的影响, 探讨附子与山茱萸配伍对CHF大鼠增效减毒作用, 为临床应用提供理论和实验依据。
 
1 材料
1.1 仪器
JCS-1000电子天平 (浙江凯丰集团有限公司) ;YD8001电子天平、JA1003N电子天平 (上海佑科仪器仪表有限公司) ;TP1020全自动组织脱水机、EG1150H+C石蜡包埋机、RM2155全自动轮转切片机、DM2500生物显微镜 (Leica公司) ;Multiskan Spectrum全波长酶标仪 (Thermo Scientific公司) ;Vevo 2100超高分辨率小动物超声影像系统 (Visualsonics公司) 。
 
1.2 药物及试剂
附子 (四川好医生药业集团有限公司, 批号16010205, 经四川好医生药业集团有限公司刘彬高级工程师鉴定为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeli Debx.的子根加工品) ;山茱萸 (四川新绿色药业科技发展股份有限公司, 批号160712, 经四川新绿色药业科技发展股份有限公司刘涛研究员鉴定为山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果肉) ;脑钠素 (BNP) 测试盒 (CUSABIO公司, 批号N260106) ;蛋白定量测定试剂盒 (批号20170512) 、超微量Na+, K+-ATP酶测定试剂盒 (批号20171017) 、超微量Ca2+-ATP酶测定试剂盒 (批号20171017) 均购自南京建成生物工程研究所;阿霉素 (MACKLIN公司, 批号C10093768、C10088736) 。
 
1.3 实验动物
SPF级雄性SD大鼠, 53只, 体质量 (200±20) g, 购自广东省医学实验动物中心, 生产许可证号SCXK (粤) 2013-0002。实验动物饲养于广东省实验动物监测所屏障环境动物房, 室温20~26℃, 相对湿度40%~70%, 12 h/12 h昼夜明暗交替。
 
2 方法
2.1 提取物的制备
2.1.1 附子提取物的制备
取1 kg附子与6 kg水浸泡0.5 h后提取4 h, 滤过后药渣再提取1 h, 合并2次滤液进行减压浓缩 (60℃, -0.08 MPa) , 浓缩至适量水浴蒸干, 再次进行减压干燥 (70℃, -0.08MPa) , 得浸膏 (1 g浸膏相当于生药材3.32 g, 其中含新乌头碱0.060 0%、次乌头碱0.044 6%、乌头碱0.156 4%、苯甲酰乌头原碱0.120 9%) 。
 
2.1.2 山茱萸提取物的制备
1 kg山茱萸加入6 kg已煮沸的水中提取1 h, 滤过后药渣再次提取1 h, 合并2次滤液进行减压浓缩 (温度不超过60℃, 真空度不低于-0.08 MPa) , 浓缩至适量, 水浴蒸干, 再次进行减压干燥 (70℃, -0.08 MPa) , 终得浸膏 (1 g浸膏相当于生药材1.65 g) 。
 
2.1.3 附子-山茱萸提取物的制备
1 kg附子加入12份水浸泡0.5 h后, 提取至3 h时加入1 kg山茱萸, 继续提取1 h, 滤过后药渣再次提取1 h, 合并2次滤液后进行减压浓缩 (70℃, -0.08 MPa) , 浓缩至适量后水浴蒸干, 再次进行减压干燥 (70℃, -0.08 MPa) , 终得浸膏 (附子与山茱萸按1∶1配伍, 1 g浸膏相当于生药材2.21 g, 其中含新乌头碱0.063 7%、次乌头碱0.092 0%、乌头碱0.149 2%、苯甲酰乌头原碱0.215 4%) 。
 
2.2 CHF大鼠模型的制备
大鼠适应性饲养1周后, 53只大鼠随机分为对照组 (10只) 和造模组 (43只) 。配制2 mg/mL阿霉素溶液, 造模组以4 mg/kg剂量ip造模, 每周1次, 连续3周。对照组动物ip 2 mL/kg生理盐水。每天进行一般观察, 末次注射后2组各随机抽取3只大鼠检测心功能、BNP水平, 并进行左心室组织病理学观察, 综合判断CHF大鼠模型成功情况。
 
2.3 分组与给药
造模3周后的大鼠根据体质量随机分为4组, 分别为模型组、附子提取物组、山茱萸提取物组和附子-山茱萸提取物组。对照组及模型组大鼠ig生理盐水, 附子提取物组、山茱萸提取物组及附子-山茱萸提取物组分别ig附子提取物 (0.972 g/kg, 相当于生药量3.227 g/kg) 、山茱萸提取物 (1.956g/kg, 相当于生药量3.227 g/kg) 及附子-山茱萸提取物 (1.460 g/kg, 相当于生药量3.227 g/kg) , 每天20 mL/kg, 连续3周。每周根据体质量调整给药量。
 
2.4 一般观察
实验期间每天观察大鼠精神状态、眼睑分泌物、活动情况、皮毛状况、呼吸频率等。
 
2.5 血清BNP水平检测
给药结束后次日, 大鼠经2%戊巴比妥钠3m L/kg麻醉后, 心脏采血, 3 000 r/min离心15 min, 取血清, 根据ELISA试剂盒说明书方法测定BNP水平。
 
2.6 心肌Ca2+-ATP酶及Na+, K+-ATP酶活性检测
给药结束后次日, 心脏采血后, 取左心室心肌于液氮中保存。测试前准确称取组织质量, 考马斯亮蓝试剂测定组织蛋白浓度, 根据Ca2+-ATP酶及Na+, K+-ATP酶测试盒说明书进行检测。
 
2.7 心脏组织病理学观察
取左心室心肌组织, 10%的中性福尔马林固定, 石蜡包埋, 常规组织切片, HE染色进行病理观察。
 
2.8 统计学处理
采用SPSS 25.0数据处理系统进行数据分析, 数据以表示, 组间差异采用单因素方差分析。
 
3 结果
3.1 CHF大鼠模型的评价
ip 4 mg/kg阿霉素溶液3周后, 造模组大鼠普遍出现腹水、消瘦、稀便、弓背、立毛等症状;与对照组比较, 造模组大鼠左心室射血分数 (EF) 及左心室短轴缩短率 (FS) 均明显降低 (P<0.05) ;左心室舒张末期内径 (LVEDD) 和左心室收缩末期内径 (LVESD) 有减小趋势;血清BNP水平明显升高 (P<0.05) ;镜下观察造模组大鼠心脏组织出现部分心肌纤维断裂、心肌细胞空泡变性、萎缩等病理改变。综上判断CHF大鼠模型成功。结果见图1和2。
 
 图1 CHF大鼠心功能参数及血清BNP水平Fig.1 Cardiac function parameters and serum BNP levels in CHF rats
图1 CHF大鼠心功能参数及血清BNP水平Fig.1 Cardiac function parameters and serum BNP levels in CHF rats   下载原图
 
与对照组比较:*P<0.05*P<0.05 vs control group
 
3.2 附子-山茱萸提取物对CHF大鼠的影响
3.2.1 一般观察
给药3周后对照组一般观察未见异常, 模型组、附子提取物组和山茱萸提取物组大鼠普遍出现腹水、体形消瘦、稀便、弓背、立毛等症状, 少数动物死亡 (模型组与山茱萸提取物组各死亡2只, 附子提取物组死亡1只) , 而附子-山茱萸提取物组个别大鼠出现轻微腹水、弓背等症状。
 
3.2.2血清BNP水平
给药3周后模型组大鼠血清BNP水平显著高于对照组 (P<0.05) , 而附子-山茱萸提取物组BNP水平明显低于模型组 (P<0.05) , 附子提取物组、山茱萸提取物组大鼠血清中BNP水平与模型组比较, 差异不显著 (P>0.05) 。结果见表1。
 
3.2.3 心肌细胞Na+, K+-ATP酶活性和Ca2+-ATP酶活性
给药3周后, 与对照组相比, 模型组大鼠心肌细胞Na+, K+-ATP酶活性明显降低 (P<0.05) ;与模型组相比, 附子-山茱萸提取物组Na+, K+-ATP酶活性显著升高 (P<0.05) , 而Ca2+-ATP酶活性各组间均无统计学差异 (P>0.05) 。附子提取物组、山茱萸提取物组大鼠心肌细胞Na+, K+-ATP酶活性和Ca2+-ATP酶活性与模型组比较, 差异不显著 (P>0.05) 。结果见表1。
 
3.2.4 心脏组织病理变化
给药3周后, 与对照组比较, 模型组大鼠出现心肌组织间隙增宽、断裂, 心肌细胞空泡变性、水肿、坏死、萎缩等病理改变。与模型组相比, 附子-山茱萸提取物组大鼠心脏病理有明显改善, 仅个别大鼠出现心肌组织间隙增宽、心肌细胞轻度空泡变性。而附子提取物组和山茱萸提取物组除心肌组织间隙增宽有所改善外, 其他组织病理未见明显改善, 出现心肌组织间隙增宽、断裂, 心肌细胞空泡变性、水肿、坏死、萎缩等。结果见图3。
 
4 讨论
传统医学认为CHF的病理基础主要为心阳不足, 古今中医名家常用温通心阳之法治疗心阳虚, 医籍记载附子为温阳圣药, 具有回阳救逆、益气固脱之功。现代研究表明附子对急性心衰具有明显的强心作用[3]。附子大毒, 在古方中常与其他药配伍使用, 如山茱萸、甘草、人参、黄芪等, 以达到减毒增效的作用[4]。现代研究发现当附子与山茱萸配伍使用时不仅明显减低了附子的心脏毒性, 而且明显增强了其温通心阳的功效[5]。
 
 图2 CHF大鼠左心室病理变化 (HE染色) Fig.2 Pathological changes of left ventricle in CHF rats (HE staining)
图2 CHF大鼠左心室病理变化 (HE染色) Fig.2 Pathological changes of left ventricle in CHF rats (HE staining)   下载原图
 
红色箭头表示心肌纤维断裂, 黑色箭头表示空泡变性Red arrow indicates rupture of myocardial fibers, black arrow indicates vacuolar degeneration of cardiac myocyte
 
现代研究发现CHF主要是由于心脏泵功能损害导致机体出现相关症状与体征的复杂临床综合征[6]。ip阿霉素是构建CHF动物模型常用的方法, 因其更加接近人CHF临床表现而被广泛认可[7]。EF和FS为反映心脏泵功能最主要的指标;临床发现CHF患者血清BNP水平明显升高, 且升高程度与CHF的严重程度呈正相关, BNP是评价CHF严重程度、药物疗效最敏感的生化指标;CHF常会引起心肌空泡变性、心肌纤维断裂、心肌细胞肿胀及坏亡等病理变化[8,9]。本研究动物经过3周ip阿霉素造模后, 模型组大鼠普遍出现腹水、体形消瘦、稀便、弓背、立毛等症状体征, 且模型组与对照组比较EF和FS均明显降低, 血清BNP水平明显升高, 心脏普遍出现空泡变性和心肌纤维断裂等病理变化。综上认为本研究CHF大鼠模型构建成功[7]
 
表1 附子-山茱萸提取物对CHF大鼠血清BNP水平及心肌细胞中Ca2+-ATP酶活性及Na+, K+-ATP酶活性的影响Table 1 Effects of compatibility of extracts from A.carmichaeli and C.officinalis on serum levels of BNP, activity of Ca2+-ATP and Na+, K+-ATP enzymes in cardiac myocytes in CHF rats     下载原表
 
 表1 附子-山茱萸提取物对CHF大鼠血清BNP水平及心肌细胞中Ca2+-ATP酶活性及Na+, K+-ATP酶活性的影响Table 1 Effects of compatibility of extracts from A.carmichaeli and C.officinalis on serum levels of BNP, activity of Ca2+-ATP and Na+, K+-ATP enzymes in cardiac myocytes in CHF rats
与对照组比较:*P<0.05;与模型组比较:#P<0.05*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs model group
 
 图3 附子-山茱萸提取物对CHF大鼠左心室病理变化的影响 (HE染色) Fig.3 Effects of compatibility of extracts from A.carmichaeli and C.officinalis on pathological changes of left ventricle in CHF rats (HE staining)
图3 附子-山茱萸提取物对CHF大鼠左心室病理变化的影响 (HE染色) Fig.3 Effects of compatibility of extracts from A.carmichaeli and C.officinalis on pathological changes of left ventricle in CHF rats (HE staining)   下载原图
 
黄色箭头表示心肌间隙增宽, 红色箭头表示心肌纤维断裂, 黑色箭头表示空泡变性, 绿色箭头表示心肌细胞坏死Yellow arrow indicates widening of myocardial space, red arrow indicates rupture of myocardial fibers, black arrow indicates vacuolar degeneration of cardiac myocyte, green arrow indicates necrosis of cardiac myocyte
 
能量代谢是心肌细胞活动的物质基础, 与能量代谢障碍相伴的心室重构被认为是CHF的主要病理生理学机制, CHF心肌中高能磷酸化合物检测已经证实这一点[10]。Na+, K+-ATP酶, 又称钠泵或钠钾泵, 主要作用为能量供给、排除细胞内废物及维持细胞压力平衡。目前研究发现当心肌细胞上钠钾泵活性持续或严重下降, 会引起钠泵严重功能障碍, 导致心肌能量代谢异常、心脏受损或心功能不全[11]。本研究发现模型组Na+, K+-ATP酶活性明显低于对照组, 而附子-山茱萸提取物ig给药3周后, Na+, K+-ATP酶活性明显回升。此外与模型组比较, 附子-山茱萸提取物组大鼠的一般状态显著改善, 血清BNP水平明显降低, 心脏病理改变有所好转, 而单独ig附子提取物和山茱萸提取物上述指标与模型组无明显差异。
 
综上所述, 本研究采用ip 4 mg/kg阿霉素3周构建CHF大鼠模型方法可靠, 附子与山茱萸配伍对CHF大鼠有一定的治疗作用, 其机制可能是两者配伍后可提高心肌细胞Na+, K+-ATP酶活性, 改善心肌能量代谢障碍, 最终增强心肌细胞活动和心脏泵功能。本研究为附子配伍山茱萸治疗CHF提供了一定的实验参考。

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文章名称:附子与山茱萸配伍对慢性心力衰竭大鼠的影响

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