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HPLC-ESI-MS/MS同时测定八珍益母丸中9种有效成分

分类:(一) 发表时间:2019-08-19

八珍益母丸 (Bazhen Yimu Pills, BYP) 是由益母草、熟地黄、当归、党参、炒白术、酒白芍、川芎、茯苓与甘草9味中药组成, 具有益气养血、活血调经的作用, 用于气血两虚兼有血瘀所致的月经
八珍益母丸 (Bazhen Yimu Pills, BYP) 是由益母草、熟地黄、当归、党参、炒白术、酒白芍、川芎、茯苓与甘草9味中药组成, 具有益气养血、活血调经的作用, 用于气血两虚兼有血瘀所致的月经不调, 症见月经周期错后、行经量少、淋漓不净、精神不振、肢体乏力[1,2]。临床研究表明, BYP具有治疗产后出血[3,4]、闭经[5]、月经不调的功效[6]。基于BYP中各单味中药的药理作用, 结合该中成药的药效基础, 确定其有效成分。
 
在《中国药典》2015年版一部中, 芍药苷作为该中成药的指标成分, 芍药苷也是中药材芍药的指标成分;益母草中的盐酸水苏碱与盐酸益母草碱具有收缩子宫与减少子宫出血的作用[7,8];当归与川芎中的阿魏酸具有抑制血小板聚集、解除血管平滑肌痉挛、抗炎止痛、抗自由基以及调节人体免疫的功能[9];党参中的党参炔苷是聚炔类化学成分, 为《中国药典》2015年版中党参质量评价的重要指标之一, 具有抗氧化、补中益气的作用[10];茯苓中的猪苓酸C为茯苓三萜酸类成分, 据文献报道[11], 茯苓三萜酸类成分具有抗炎、免疫调节的药理作用;熟地黄中的毛蕊花糖苷具有抗炎、抗氧化的药理作用[12];白术中的白术内酯I对卵巢癌细胞具有抑制作用[13];甘草中的甘草苷具有抗炎与抗氧化的作用[14]。结合BYP的质量研究相关文献报道[15,16,17,18,19,20,21], 最终确定盐酸水苏碱、盐酸益母草碱、芍药苷、阿魏酸、甘草苷、党参炔苷、毛蕊花糖苷、白术内酯I和猪苓酸C 9种成分作为BYP的质量研究的指标性成分。
 
为了更好地检测该中成药的指标性成分, 本实验采用液质联用方法进行定量测定。因此, 本实验首次建立了HPLC-ESI-MS/MS同时测定BYP中9种有效成分的方法, 所建立的分析方法简单、灵敏度高、专属性好, 可应用于不同厂家、不同生产批次的BYP中有效成分的测定及质量控制。
 
1 仪器与试药
4500QtrapTM质谱仪, 美国Applied Biosystem公司;XPE105型电子天平, 瑞士梅特勒托利多公司;KD2000超声仪, 昆山超声仪器有限公司。
 
对照品阿魏酸 (批号110773-201313, 质量分数99.6%) 、盐酸水苏碱 (批号110712-201614, 质量分数100%) 、盐酸益母草碱 (批号111823-201704, 质量分数95.2%) 、芍药苷 (批号110736-201741, 质量分数95.2%) 、甘草苷 (批号111610-201607, 质量分数93.7%) 、党参炔苷 (批号111732-201607, 质量分数99.6%) 、毛蕊花糖苷 (批号111530-201713, 质量分数96.7%) 和白术内酯I (批号111975-201501, 质量分数以99.9%计) 均购自中国食品药品检定研究院;对照品猪苓酸C (批号20170202, 质量分数99.4%) 购于成都德思特生物技术有限公司;甲醇为色谱纯, 美国西格玛公司;水为超纯水, 其余试剂均为分析纯。
 
9批BYP购于药店, 分别来源于吉林金麦通制药有限公司 (批号20170604、20170808、20171120, S1~S3) 、沈阳中药制药有限公司 (批号20170311、20170523、20170909, S4~S6) 、长春新安药业有限公司 (批号20170425、20170714、20171211, S7~S9) 。
 
2 方法与结果
2.1 高效液相色谱条件
色谱柱为Waters Atlantis T3柱 (150 mm×4.6mm, 3.0μm) ;柱温40℃;流动相为甲醇-0.1%甲酸水溶液, 体积流量0.5 mL/min;梯度洗脱:0~5min, 60%甲醇;5~8 min, 60%~65%甲醇;8~12min, 65%~75%甲醇;12~20 min, 75%~80%甲醇;20~25 min, 60%甲醇;进样量为10μL。
 
2.2 质谱条件
质谱采用电喷雾离子源;负离子模式 (ESI-) ;多反应监测 (MRM) ;离子源喷雾电压5 500 V;雾化温度600℃;雾化器气体 (gas1) 60 psi (1 psi=6.895 kPa) ;辅助器气体 (gas2) 60 psi;载气N2 35psi。质谱数据的相关参数见表1。混合对照品溶液、供试品溶液的总离子流图和9种成分的二级质谱图见图1。
 
2.3 混合对照品溶液制备
精密称取盐酸水苏碱、盐酸益母草碱、芍药苷、阿魏酸、甘草苷、党参炔苷、毛蕊花糖苷、白术内酯I和猪苓酸C适量, 分别置50 mL量瓶中, 加甲醇-水 (1∶1) 溶解并稀释至刻度, 得各对照品储备液, 备用。再精密吸取各对照品储备液适量置100m L量瓶中, 甲醇-水 (1∶1) 稀释至刻度, 得含盐酸水苏碱4.0μg/mL、盐酸益母草碱4.0μg/mL、芍药苷10μg/m L、阿魏酸2.0μg/mL、甘草苷2.0μg/mL、党参炔苷0.5μg/mL、毛蕊花糖苷1.0μg/mL、白术内酯I 1.0μg/mL和猪苓酸C 1.0μg/mL的混合对照品溶液, 备用, 低温避光保存。
 
2.4 供试品溶液制备
取装量差异项下的大蜜丸, 剪碎, 混匀, 取约1 g, 精密称定, 置具塞锥形瓶中, 精密加入稀乙醇25 mL, 密塞, 称定质量, 超声处理 (功率250 W, 频率25 kHz) 40 min, 放冷, 再称定质量, 用稀乙醇补足减失的质量, 摇匀, 滤过, 离心, 取上清液, 即得。
 
表1 BYP 9种有效成分的质谱数据Table 1 HPLC-ESI-MS/MS data of nine effective components in BYP     下载原表
 
 表1 BYP 9种有效成分的质谱数据Table 1 HPLC-ESI-MS/MS data of nine effective components in BYP
 图1 混合对照品溶液 (A) 、供试品溶液 (B) 的总离子流图和9种成分的二级质谱图 (C) Fig.1 Total-ion chromatograms of mixed reference substances (A) , samples (B) and second mass spectrum of reference substances (C)
图1 混合对照品溶液 (A) 、供试品溶液 (B) 的总离子流图和9种成分的二级质谱图 (C) Fig.1 Total-ion chromatograms of mixed reference substances (A) , samples (B) and second mass spectrum of reference substances (C)   下载原图
 
1-阿魏酸2-猪苓酸C 3-白术内酯I 4-芍药苷5-盐酸水苏碱6-盐酸益母草碱7-党参炔苷8-毛蕊花糖苷9-甘草苷1-ferulic acid 2-polyporenic acid C 3-atracylenolide I 4-paeoniflorin 5-stachydrine hydrochloride 6-leonurine hydrochloride 7-lobetyolin 8-verbascoside 9-liquiritin
 
2.5 线性关系考察、检测限与定量限
精密吸取按“2.3”项下方法制备的混合对照品储备液适量, 分别置100 mL量瓶中, 以甲醇-水1∶1定容, 摇匀, 即得系列质量浓度的混合对照品溶液。分别吸取上述系列混合对照品溶液各10μL, 注入液相色谱仪, 记录色谱图。以峰面积积分值 (Y) 对质量浓度 (X) 进行线性回归, 得回归方程, 见表2。
 
表2 BYP中9种有效成分的线性方程、检出限与定量限Table 2 Calibration curves, LOD, and LOQ of nine effective components in BYP     下载原表
 
 表2 BYP中9种有效成分的线性方程、检出限与定量限Table 2 Calibration curves, LOD, and LOQ of nine effective components in BYP
2.6 精密度试验
精密吸取同一对照品溶液10μL, 重复进样6次, 记录峰面积。结果显示, 盐酸水苏碱、盐酸益母草碱、芍药苷、阿魏酸、甘草苷、党参炔苷、毛蕊花糖苷、白术内酯I和猪苓酸C的峰面积RSD值分别为0.85%、0.99%、1.12%、1.24%、0.72%、1.04%、0.53%、0.76%、1.11%, 表明精密度良好。
 
2.7 重复性试验
取一批BYP (批号20170604) 6份, 按“2.4”项下方法平行制备6份供试品溶液, 按“2.1”“2.2”项下液相色谱条件与质谱条件测定, 结果显示, 盐酸水苏碱、盐酸益母草碱、芍药苷、阿魏酸、甘草苷、党参炔苷、毛蕊花糖苷、白术内酯I和猪苓酸C的平均质量分数的RSD分别为0.68%、1.06%、0.84%、0.88%、1.18%、0.61%、0.97%、0.66%、0.60%, 表明方法的重复性良好。
 
2.8 稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液 (批号20170604) 各10μL, 按“2.1”“2.2”项下液相色谱条件与质谱条件分别于0、2、4、6、8、12、18、24 h进样测定, 结果显示盐酸水苏碱、盐酸益母草碱、芍药苷、阿魏酸、甘草苷、党参炔苷、毛蕊花糖苷、白术内酯I和猪苓酸C的平均质量分数RSD均小于2.0%, 表明供试品溶液在24 h内基本稳定。
 
2.9 加样回收率试验
取同一批号样品 (批号为20170604) 9份, 每份约1.0 g, 精密称定, 分成3组, 分别按已知质量分数的50%、100%、150%3个水平加入混合对照品溶液, 按“2.4”项下方法制备, 依法测定, 计算回收率。盐酸水苏碱、盐酸益母草碱、芍药苷、阿魏酸、甘草苷、党参炔苷、毛蕊花糖苷、白术内酯I和猪苓酸C的平均回收率分别为99.7%、98.1%、98.5%、101.5%、99.5%、98.4%、99.1%、101.2%、100.1%, RSD分别为0.52%、0.64%、1.08%、1.12%、0.39%、0.74%、0.91%、0.54%、0.47%。
 
2.1 0 耐用性考察
取批号为20170604的BYP适量, 按照“2.4”项下供试品溶液制备方法配制, 按“2.1”“2.2”项下液相色谱条件与质谱条件进行分析, 记录色谱图。考察不同柱温、不同体积流量微小变化及不同批号色谱柱变化对测定的影响。结果显示, 柱温、体积流量与流动相比例的微小变化对样品的测定无明显影响, 表明耐用性良好。
 
2.1 1 样品测定
取收集到的9批样品, 按“2.4”项下方法制备供试品溶液, 依法测定, 用外标法计算样品中盐酸水苏碱、盐酸益母草碱、芍药苷、阿魏酸、甘草苷、党参炔苷、毛蕊花糖苷、白术内酯I和猪苓酸C的量, 结果见表3。9批次供试品中盐酸水苏碱、盐酸益母草碱、芍药苷、阿魏酸、甘草苷、党参炔苷、毛蕊花糖苷、白术内酯I和猪苓酸C质量分数分别为0.423~0.752、0.505~0.722、0.613~1.300、0.102~0.184、0.195~0.255、0.021~0.035、0.034~0.072、0.039~0.063、0.051~0.095 mg/g。其中由于厂家购买的药材产地来源的差异与制备工艺的不同, 导致测定结果的差异。在S1~S3样品中, 阿魏酸的含量较低;在S4~S6样品中, 芍药苷的含量高于其他2个厂家, 但是其他2个厂家的芍药苷都符合《中国药典》2015年版的标准;在S7~S9样品中, 毛蕊花糖苷的含量较低。
 
表3 BYP中9种有效成分的测定结果Table 3 Quantitative determination of nine components in BYP     下载原表
 
 表3 BYP中9种有效成分的测定结果Table 3 Quantitative determination of nine components in BYP
3 讨论
液质联用的分析方法是专属性比较高的测定方法, 目前, 已经广泛应用于中成药的质量标准研究中[22,23], 特别是该中成药中的盐酸水苏碱紫外没有吸收, 不适合采用液相色谱法进行分析。本实验首次建立了液质联用法同时测定BYP中9种指标成分的方法, 有利于提高该中成药的质量标准。
 
由于9种指标成分的极性差异较大, 同时考虑到质谱对流动相的要求, 本课题组选用了不同填料的色谱柱进行研究, 包括氨基柱、氰基柱、C8柱、苯基柱等, 最终选择色谱柱Waters Atlantis T3柱, 更有利于各个成分的分离。对质谱条件进行了优化, 9种成分在负离子模式下响应更好;在负离子模式下对气体体积流量、雾化温度、裂解电压等进行了优化, 确定了最优的质谱条件。

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文章名称:HPLC-ESI-MS/MS同时测定八珍益母丸中9种有效成分

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