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复方石韦片HPLC指纹图谱的建立及其在制剂过程中的应用

分类:(一) 发表时间:2019-08-19

复方石韦片 (Compound Shiwei Tablets, CST) 是由石韦、黄芪、苦参、萹蓄等组成的中药复方制剂, 方由《证治汇补》中的石韦散化裁而来[1], 为国家中药保护品种。其质量标准收载于《中国药典
复方石韦片 (Compound Shiwei Tablets, CST) 是由石韦、黄芪、苦参、萹蓄等组成的中药复方制剂, 方由《证治汇补》中的石韦散化裁而来[1], 为国家中药保护品种。其质量标准收载于《中国药典》2015年版, 具有清热燥湿、利尿通淋的功能, 用于下焦湿热所致的热淋, 症见小便不利、尿频、尿急、尿痛、下肢浮肿;用于急性肾小球肾炎、肾盂肾炎、膀胱炎、尿道炎[2,3]。CST以其疗效独特深受临床医生的信赖和广大患者的欢迎, 具有很好的市场前景。
 
CST现行标准中, “含量测定”项下采用黄芪中的黄芪甲苷和苦参中的苦参碱进行含量测定以控制其质量。笔者查阅相关文献也多对CST及其相关制剂中的1种或2种成分进行定性或定量研究[4,5,6,7,8,9,10,11,12]。CST属于中药复方制剂, 具有化学成分复杂性和整体治疗性等特点。指纹图谱作为一种多指标综合评价的质量控制模式, 可以较全面地对中药复方制剂所含化学成分进行定性及定量分析, 更具有科学性和全面性[13,14,15,16,17,18,19,20,21]。本实验旨建立CST的HPLC指纹图谱, 使其质控指标由对单一成分的含量测定上升到制剂整体的质量控制, 并将建立的方法应用于CST制剂工艺过程中的质量控制, 以初步研究CST中间体和成品之间的相似度及化学成分变化情况[22,23,24], 这对CST生产过程全方位质量控制具有重要意义。
 
1 仪器与试药
1.1 仪器
Agilent 1200型高效液相色谱仪-VWD检测器、Agilent 1260型高效液相色谱仪-DAD检测器, 美国Agilent公司;MS204TS/02型电子天平、XSE205DU十万分之一电子分析天平, 梅特勒-托利多仪器 (上海) 有限公司;KQ-500DE数控超声波清洗器, 昆山市超声仪器有限公司;Milli-Q超纯水系统, 美国Millipore公司。
 
1.2 试药
对照品绿原酸 (批号110753-201716, 质量分数99.3%) 、毛蕊异黄酮葡萄糖苷 (批号111920-201606, 质量分数97.6%) 、没食子酸 (批号0831-950, 质量分数100%) 、杨梅苷 (批号111860-201102, 质量分数93.8%) , 均购于中国食品药品检定研究院;对照品毛蕊异黄酮 (批号151208, 质量分数≥98%) 购于成都普菲德生物技术有限公司;乙腈、甲醇, 色谱纯, 美国Mreda公司;甲醇, 分析纯, 天津市科密欧化学试剂有限公司;磷酸, 优级纯, 天津欧博凯化工有限公司;水为Milli Q超纯水。
 
CST, 颈复康药业集团有限公司, 批号分别为630286、630076、730381、730385、730389、730390、730391、730425、730428、830117、830118、830121、830122、830182, 分别编号为S1~S14;CST中间体 (浸膏、颗粒) , 颈复康药业集团有限公司, 批号分别为730389、730390、730391;石韦为水龙骨科植物有柄石韦Pyrrosia petiolosa (Christ) Ching.的干燥叶、黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.var.mongholicus (Bge.) Hsiao的干燥根、苦参为豆科植物苦参Sophora flavescens Ait.的干燥根、萹蓄为廖科植物萹蓄Polygonum aviculare L.的干燥地上部分, 以上药材均由颈复康药业集团有限公司提供, 并由颈复康药业集团有限公司工程师、中药鉴别师商春丽鉴定为正品。
 
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为Agilent 5 TC C18 (2) 色谱柱 (250mm×4.6 mm, 5μm) , 流动相为乙腈 (A) -0.2%磷酸水 (B) 溶液, 梯度洗脱:0~30 min, 3%~11%乙腈;30~45 min, 11%~16%乙腈;45~90 min, 16%~30%乙腈;温度25℃;体积流量1.0 mL/min;检测波长235 nm;进样量10μL。
 
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备
称取没食子酸、绿原酸、杨梅苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和毛蕊异黄酮对照品适量, 精密称定, 加甲醇分别配制成含没食子酸73μg/mL、绿原酸176μg/mL、杨梅苷8.57μg/mL、毛蕊异黄酮葡萄糖苷32μg/mL和毛蕊异黄酮17μg/mL的混合对照品溶液。
 
2.2.2 供试品溶液的制备
取本品, 除薄膜衣研细, 取粉末约1 g, 精密称定, 置具塞锥形瓶中, 精密加入60%甲醇20 mL, 称定质量, 超声 (500 W, 40 kHz) 提取50 min, 放至室温, 再称定质量, 用60%甲醇补足减失的质量, 摇匀, 滤过, 取续滤液过0.45μm微孔滤膜, 即得。
 
2.2.3 各单味药材溶液的制备
取黄芪、石韦、苦参、萹蓄4味药材细粉, 分别按处方比例及制剂工艺制备, 精密称定质量, 置具塞锥形瓶中, 按“2.2.2”项下方法制备各单味药材供试品溶液。
 
2.2.4 阴性对照溶液的制备
按CST处方中的药味比例及制备工艺过程, 分别制备缺黄芪、苦参、石韦和萹蓄的阴性样品, 按“2.2.2”项下方法制备各阴性对照样品溶液。
 
2.3 方法学考察
2.3.1 专属性试验
取空白溶液 (60%甲醇) , 按“2.1”项下的色谱条件进样, 结果在溶剂色谱图中未出现干扰样品检测的杂峰, 表明60%甲醇溶剂对CST样品检测无干扰。
 
2.3.2 精密度试验
取同一批次CST (批号730389) , 按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液, 按“2.1”项下色谱条件连续进样6次, 计算各共有峰相对保留时间及相对峰面积, 结果各共有峰相对保留时间的RSD值均<0.3%;相对峰面积的RSD值均<2.2%, 表明仪器精密度良好。
 
2.3.3 重复性试验
取同一批次CST (批号730389) , 按“2.2.2”项下方法平行制备供试品溶液6份, 按“2.1”项下色谱条件进样, 计算各共有峰相对保留时间及相对峰面积, 结果各共有峰相对保留时间的RSD值均<0.3%;相对峰面积的RSD值均<2.7%, 表明方法重复性良好。
 
2.3.4 稳定性试验
取同一批次CST (批号730389) , 按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液, 按“2.1”项下色谱条件, 分别于0、2、4、6、8、10、12 h进样, 计算各共有峰相对保留时间及相对峰面积, 结果各共有峰相对保留时间的RSD值均<0.3%;相对峰面积的RSD值均<2.5%, 表明供试品溶液在12 h内保持稳定。
 
2.4 CST指纹图谱的建立与分析
2.4.1 指纹图谱的建立及相似度分析
取上述14批CST, 按“2.2.2”项下方法分别制备供试品溶液, 按“2.1”项下色谱条件进样测定, 记录色谱图。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》 (2012年版) 对测定结果进行评价, 以S7为参考图谱, 设定时间窗宽度为0.1 min, 选用多点校正法生成CST指纹图谱共有模式, 采用中位数法得出对照指纹图谱 (图1) , 根据匹配结果共确定了18个共有峰, 其中7号峰 (绿原酸) 的分离度及对称性良好且峰面积适中, 故将其作为参照峰。对14批CST的指纹谱图进行相似度计算, 结果S1~S14样品的相似度分别为0.998、0.996、0.998、0.997、0.998、0.999、0.999、0.999、0.997、0.998、0.999、0.999、0.999、0.998, 结果表明14批CST的相似度均大于0.990, 相似度较高, 说明CST成品质量稳定, 建立的指纹图谱方法应用于其质量控制较可靠。
 
2.4.2 共有峰的归属
分别取供试品溶液、各阴性对照溶液及各单味药材溶液, 按“2.1”项下色谱条件进行测定, 记录色谱图, 将其与成品色谱图中各色谱峰的相对保留时间及紫外吸收光谱进行比较, 确定其共有峰的归属。结果显示 (图2) , 本研究建立的CST指纹图谱中18个共有峰均可在其药材中找到归属, 其中1、5、6、7、8、12、13、14号色谱峰为石韦药材中的色谱峰, 3、4、9、15、17号峰为苦参药材中的色谱峰, 10、16、18号峰为黄芪药材中的色谱峰, 2、11号峰为萹蓄药材中的色谱峰。结果说明CST与其组方药材之间存在良好的相关性。
 
2.4.3 共有峰的指认
采用对照品对共有峰进行指认, 经过对供试品和对照品色谱图相对保留时间及紫外吸收光谱2项指标的比对, 确定了其中5个共有峰, 分别为2号峰 (没食子酸) 、7号峰 (绿原酸) 、10号峰 (毛蕊异黄酮葡萄糖苷) 、11号峰 (杨梅苷) 和18号峰 (毛蕊异黄酮) , 结果见图3。
 
2.5 CST指纹图谱方法在其制剂过程中的应用
分别取相同批号的CST颗粒、浸膏和成品3批, 按“2.2.2”项下方法分别制备供试品溶液, 按“2.1”项下色谱条件进样测定, 记录色谱图 (图4) , 结果建立的CST指纹图谱中的共有峰在其颗粒及浸膏的色谱图中均有体现, 将各批次CST颗粒、浸膏及成品色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》 (2012年版) 对其进行相似度评价, 结果见表1, 3 批CST颗粒、浸膏及成品指纹图谱间的相似度均大于0.990, 相似度较高, 说明CST制备工艺过程稳定, 各主要成分由浸膏、颗粒到成品相关性良好。
 
 图1 14批CST指纹图谱及其对照指纹图谱 (R) Fig.1 Fingerprint of 14 batches of CST and its reference fingerprint (R)
图1 14批CST指纹图谱及其对照指纹图谱 (R) Fig.1 Fingerprint of 14 batches of CST and its reference fingerprint (R)   下载原图
 
 图2 CST指纹图谱中共有峰归属Fig.2 Common peak attribution map in fingerprint of CST
图2 CST指纹图谱中共有峰归属Fig.2 Common peak attribution map in fingerprint of CST   下载原图
 
 图3 混合对照品 (A) 及供试品 (B) 的HPLC图Fig.3 HPLC of mixed reference substances (A) and test sample (B)
图3 混合对照品 (A) 及供试品 (B) 的HPLC图Fig.3 HPLC of mixed reference substances (A) and test sample (B)   下载原图
 
2-没食子酸7-绿原酸10-毛蕊异黄酮葡萄糖苷11-杨梅苷18-毛蕊异黄酮2-gallic acid 7-chlorogenic acid 10-calycosin-7-glucoside11-myricetrin 18-calycosin
 
 图4 730389、730390、730391批CST成品-颗粒-浸膏指纹图谱Fig.4 Batch No.730389, 730390, and 730391 of CST finished product-granules-extracts fingerprint
图4 730389、730390、730391批CST成品-颗粒-浸膏指纹图谱Fig.4 Batch No.730389, 730390, and 730391 of CST finished product-granules-extracts fingerprint   下载原图
 
a-成品b-颗粒c-浸膏a-CST b-granules c-extracts
 
表1 CST成品-颗粒-浸膏指纹图谱相似度Table 1 Similarity of CST finished product-granules-extracts fingerprint     下载原表
 
 表1 CST成品-颗粒-浸膏指纹图谱相似度Table 1 Similarity of CST finished product-granules-extracts fingerprint
3 讨论
3.1 供试品溶液制备条件的优化
3.1.1 提取溶剂考察
本研究考察了不同提取溶剂 (甲醇、80%甲醇、60%甲醇、40%甲醇、乙醇、80%乙醇、60%乙醇、40%乙醇) 对CST样品进行处理, 比较其色谱图, 结果显示使用60%甲醇作为提取溶剂, 各色谱峰分离效果好, 峰面积大, 提取较完全。
 
3.1.2提取方法考察
本研究考察了超声和加热回流2种提取方法, 结果2种方法的色谱图峰面积及数目无明显差异, 考虑到超声法操作较简便, 因此选用超声法。
 
3.1.3 提取时间考察
本研究考察了不同超声时间 (30、40、50、60 min) , 结果显示超声50 min时与60 min各共有峰峰面积无明显差别, 且均高于超声30、40 min, 说明超声50 min可提取完全, 因此超声时间定为50 min。
 
3.2 色谱条件的优化
3.2.1 色谱柱的选择
分别考察了Agilent 5 TC C18 (2) (250 mm×4.6 mm, 5μm) , Agilent 5-HC C18 (2) (250 mm×4.6 mm, 5μm) , Intersil ODS-3 (250mm×4.6 mm, 5μm) , 3种不同型号色谱柱, 结果表明采用Agilent 5 TC C18 (2) 色谱柱 (250 mm×4.6 mm, 5μm) 时, 综合考虑指纹谱图的色谱峰峰形及分离度等方面均优于其他型号色谱柱, 故确定该色谱柱进行指纹图谱分析。
 
3.2.2 检测波长的选择
应用DAD检测器对供试样品进行190~400 nm的全波长扫描, 选取225、235、265、285、300、320 nm等处的检测波长进行比较分析, 结果表明在235 nm波长下所反映的色谱峰信息较多, 各峰分离较好、峰高比例协调且基线平稳, 故将检测波长设定为235 nm。
 
3.3 辅料干扰考察
CST中的辅料成分为淀粉, 为了排除淀粉对色谱图的影响, 将其按供试品溶液制备方法及色谱条件进行制备并测定, 结果色谱图中未观察到干扰样品检测的杂峰, 说明辅料淀粉对CST样品指纹图谱的检测无干扰。
 
3.4 制剂过程质量控制的应用
将CST中间体 (颗粒、浸膏) 及对应成品的指纹图谱进行比较分析, 其中共有峰一致, 且同批次中间体和成品的色谱图相似度较好, 说明将建立CST指纹图谱方法应用于其制剂过程的质量控制稳定、可行。但由于实验批次较少, 得出结论代表性不足, 因此需要收集更多样品积累实验数据, 以深入探讨CST制剂过程的整体质量控制, 从而更科学、更有效地全面控制CST的质量。

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