提供论文发表、期刊发表、证书、著作、课题申请、专利等一条龙服务——畅志文化期刊网您负责教书育人,我们负责解决您职称,晋级路上遇到的难题。

止动颗粒UPLC指纹图谱建立及3种成分测定

分类:(一) 发表时间:2019-08-19

止动颗粒是由白芍、天麻、栀子、黄芩、蒺藜、钩藤、灵芝、首乌藤、酸枣仁、醋五味子、胆南星11味药材制备而成的中成药, 辅料为糊精和阿司帕坦, 具有平肝息风、清火豁痰、宁心安
止动颗粒是由白芍、天麻、栀子、黄芩、蒺藜、钩藤、灵芝、首乌藤、酸枣仁、醋五味子、胆南星11味药材制备而成的中成药, 辅料为糊精和阿司帕坦, 具有平肝息风、清火豁痰、宁心安神的功效, 用于以面部、头颈、四肢或躯干部位肌肉不自主的抽动伴有喉部发声为临床表现的抽动症具有显著疗效[1]。为了能更好地控制该产品的质量, 保证临床疗效, 需建立全面评价该制剂质量的方法。中药指纹图谱技术能从整体层面全面准确地体现中药质量, 该技术具有系统性、特征性和重现性特点[2], 是目前能够为国内外广泛接受的一种中药质量评价模式[3,4,5,6,7,8];而UPLC相比HPLC具有分离度高、速度快、灵敏度高等特点[9]。因此本实验根据止动颗粒主要成分的特性, 以黄芩苷为参照峰, 建立了止动颗粒UPLC指纹图谱, 然后采用Q-TOF-MS鉴定16个共有峰成分, 并测定了11批样品, 为全面提升止动颗粒质量标准提供依据。现有质量标准只对单一成分为含量测定的指标, 没有突出中药多成分、多途径、多靶标的特点[10], 根据本实验室药动学研究结果, 栀子苷、芍药苷和黄芩苷为止动颗粒的主要入血成分, 且含量较高, 并且为指纹图谱中的共有峰成分, 因此本实验拟通过建立多波长UPLC[11]法测定此3种成分的含量, 以进一步完善止动颗粒的质量标准。
 
1 仪器及材料
1.1 仪器
超高效液相系统Acquity UPLCTM系统, 包括二元梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、PDA检测器, 美国Waters公司;Mettler Toledo Xs205分析天平, 瑞士Mettler Toledo公司;Waters Q-TOF Premier质谱仪, 英国Waters MS Technologies公司;KQ-500DE型数控超声波清洗器, 昆山市超声仪器有限公司;Milli-Q超纯水系统, 美国Millipore公司;ST16R高速冷冻离心机, Thermo Fisher公司。
 
1.2 试剂与样品
甲酸、乙腈为色谱纯, Merck公司;娃哈哈纯净水。止动颗粒由天士力控股集团有限公司研究院提供, 共11批, 批号为20110102、2014L01、140901S、20150701、150801、150802、150901、151001、151002、20171102、20180501, 分别编号为S1~S11;各阴性样品均由天士力控股集团有限公司研究院提供。对照品黄芩苷 (批号110715-201318, 质量分数93.3%) 、栀子苷 (批号110749-201718, 质量分数97.6%) 、芍药苷 (批号110736-201741, 质量分数95.7%) 、没食子酸 (批号110831-201204, 质量分数89.9%) 、绿原酸 (批号110753-201415, 质量分数96.4%) , 均购自中国食品药品检定研究院。
 
2 方法与结果
2.1 UPLC指纹图谱
2.1.1 色谱条件
Acquity HSS T3色谱柱 (150mm×2.1 mm, 1.8μm) ;流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈;体积流量0.3 mL/min;柱温40℃;进样量2μL;紫外检测波长254 nm。梯度洗脱程序:0~3 min, 3%乙腈;3~7 min, 3%~7%乙腈;7~13 min, 7%~14%乙腈;13~24 min, 14%~28%乙腈;24~27 min, 28%~35%乙腈;27~30 min, 35%~65%乙腈;30~32 min, 65%~90%乙腈;32~34 min, 90%乙腈;34~35 min, 90%~3%乙腈。
 
2.1.2 质谱条件
采用电喷雾离子化源 (ESI) , MSE扫描正负离子模式检测, 扫描范围m/z 50~1 500, 用亮氨酸脑啡肽作校正液, 进行实时校正。毛细管电压负离子模式2.5 kV, 正离子模式2.8 kV, 锥孔电压为40 V, 雾化气为高纯度氮气, 体积流量为50L/h, 碰撞气为氩气, 脱溶剂气体积流量800 L/h, 脱溶剂温度为350℃, 离子源温度为110℃。高能量扫描时trap电压为20~60 eV。
 
2.1.3 对照品溶液的制备
精密称取黄芩苷对照品12.62 mg, 置于100 m L量瓶中, 甲醇定容, 摇匀, 制成126.2μg/mL的对照品溶液, 0.22μm滤膜滤过, 备用。
 
2.1.4 供试品溶液的制备
称定止动颗粒粉末0.5g, 置于具塞锥形瓶中, 加入10%甲醇50 mL, 称定质量, 超声15 min, 放冷, 补足减失的质量, 摇匀, 14 100 r/min离心10 min, 上清液用0.22μm微孔滤膜滤过, 取续滤液即得供试品溶液。
 
2.1.5 精密度试验
取供试品溶液 (S8) 连续进样6次, 以黄芩苷为参照峰, 记录色谱图, 计算各色谱峰相对保留时间、相对峰面积, 测得各色谱峰的相对保留时间RSD均小于1%, 相对峰面积RSD均小于5%, 结果表明仪器精密度良好。
 
2.1.6 重复性试验
取同一批样品 (S8) , 按“2.1.4”项下供试品制备方法制得6份供试品溶液, 以“2.1.1”项色谱条件进样, 以黄芩苷为参照峰, 记录色谱图, 计算各色谱峰相对保留时间、相对峰面积, 测得各色谱峰的相对保留时间RSD<1%, 相对峰面积RSD<5%。结果表明本方法重复性良好。
 
2.1.7 稳定性试验
取同一批样品 (S8) , 按“2.1.4”项下供试品制备方法制得供试品溶液, 以“2.1.1”项色谱条件, 分别在0、2、4、8、12、24 h进样分析, 以黄芩苷为参照峰, 记录色谱图, 计算各色谱峰相对保留时间、相对峰面积, 测得各色谱峰的相对保留时间RSD<1%, 相对峰面积RSD<5%。结果表明, 供试品溶液室温放置24 h内稳定。
 
2.1.8 指纹图谱的建立
将11批止动颗粒的供试品溶液依次进样分析, 采集色谱图。对各批次供试品图谱进行积分, 导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版本”软件, 以黄芩苷 (11号峰) 为参照峰 (S) , 计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积, 确定254 nm条件下16个共有峰, 并按均值法生成对照指纹图谱, 最终得到指纹图谱, 结果见图1。
 
2.1.9 相似度评价
将11批止动颗粒制剂的cdf.格式图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012A版相似度软件, 进行相似度评价, 结果S1~S11的相似度分别为0.999、0.994、0.996、0.992、0.998、0.999、0.999、0.991、0.998、0.983、0.989。结果显示, 11批制剂相似度均大于0.98, 说明其相似度较好, 工艺稳定可控, 质量一致性较好。结果表明止动颗粒不同批次制剂质量稳定, 特征图谱可以用于止动颗粒质量的评价和控制。
 
 图1 11批止动颗粒的UPLC指纹图谱 (A) 及其对照指纹图谱 (B) Fig.1 UPLC fingerprints (A) and reference fingerprints (B) of 11 batches of Zhidong Granules
图1 11批止动颗粒的UPLC指纹图谱 (A) 及其对照指纹图谱 (B) Fig.1 UPLC fingerprints (A) and reference fingerprints (B) of 11 batches of Zhidong Granules   下载原图
 
2.1.1 0 共有峰指认
按“2.1.4”项下方法制备供试品溶液, 在“2.1.1”及“2.1.2”项条件下进样, 得到正、负离子模式下全扫描BPI图 (图2) 。以黄芩苷为参照峰, 根据相对保留时间分析与UPLC-DAD色谱图对应的共有峰, 根据文献建立组方药材的化学成分信息库, 利用Q-TOF-MS获得精确相对分子质量, 再应用MassLynx软件对成分进行推断, 参考相关文献中的质谱裂解途径对色谱峰鉴定[12,13,14,15,16,17,18,19,20], 同时对色谱峰进行药材归属。以7号峰为例, 进行解析, 在负离子模式下一级碎片离子中, 明显含有蒎烷基本骨架的芍药苷准分子离子m/z 449.143 8[M-HCHO-H]-比m/z 525.161 6[M+COOH]-响应强度更高。其碎片信息:m/z 479.152 3、449.143 8、327.104 8、165.042 8、121.024 7、77.039 9, 其中m/z449.143 8是母离子[M-H]-m/z 479.152 3断裂1分子甲醛HCHO (30) 形成, m/z 327.104 8[M-H-30-122]-是母离子同时脱去母核1分子苯甲酸 (122) 和1分子甲醛产生, m/z 165.054 8[pinane skeleton-H]-由分子离子峰m/z 479.152 3断裂形成的蒎烷基本骨架结构的羟基苯甲酸碎片信息, m/z 121.024 7是m/z165.042 8丢失1分子COO-得到的苯甲酸碎片信息, m/z 77.039 9是苯甲酸丢失1分子COO-产生的碎片离子。正离子模式下, 母离子m/z 503.153 3[M+Na]+分别丢失1分子葡萄糖基 (hexose residue, 162) 和苯甲酸得到m/z 341.116 2[M+Na-Glc]+, m/z381.110 7[M+Na-benzoic acid]+, 故初步确定7号峰为芍药苷 (图3) 。再经与芍药苷对照品比对, 确认7号峰为芍药苷。根据文献信息及现有研究表明[8,9], 在本组方中, 芍药苷是白芍中的成分, 因此确定药材归属为白芍。以此类推, 本实验共解析了止动颗粒色谱图中16个化学成分并分别归属于白芍、栀子、黄芩、醋五味子4味药材, 结果见表1。
 
 图2 止动颗粒UPLC-Q-TOF-MS的正离子 (A) 和负离子 (B) 质谱基峰离子流图Fig.2 Positive (A) and negative (B) UPLC-Q-TOF-MS base peak ion flow chart of Zhidong Granules
图2 止动颗粒UPLC-Q-TOF-MS的正离子 (A) 和负离子 (B) 质谱基峰离子流图Fig.2 Positive (A) and negative (B) UPLC-Q-TOF-MS base peak ion flow chart of Zhidong Granules   下载原图
 
 图3 对照品溶液 (I) 和止动颗粒样品溶液 (II) 中芍药苷的UPLC-Q-TOF-MS负离子 (A) 和正离子 (B) 质谱图Fig.3 Negative (A) and positive (B) UPLC-Q-TOF-MS spectrum of paeoniflorin in reference solution (I) and Zhidong Granules sample solution (II)
图3 对照品溶液 (I) 和止动颗粒样品溶液 (II) 中芍药苷的UPLC-Q-TOF-MS负离子 (A) 和正离子 (B) 质谱图Fig.3 Negative (A) and positive (B) UPLC-Q-TOF-MS spectrum of paeoniflorin in reference solution (I) and Zhidong Granules sample solution (II)   下载原图
 
表1 共有峰鉴定结果Table 1 Results of common peak identification     下载原表
 
 表1 共有峰鉴定结果Table 1 Results of common peak identification
*代表样品与对照品比对*Confirmation in comparison with standard substances in MS spectra
 
2.2 含量测定
2.2.1 色谱条件
色谱柱为Acquity HSS T3柱 (150mm×2.1 mm, 1.8μm) ;流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈;体积流量0.3 mL/min;柱温40℃;进样量2μL;紫外检测波长240、280 nm。梯度洗脱程序:0~3 min, 3%乙腈;3~7 min, 3%~7%乙腈;7~13 min, 7%~14%乙腈;13~24 min, 14%~28%乙腈;24~27 min, 28%~35%乙腈;27~30 min, 35%~65%乙腈;30~32 min, 65%~90%乙腈;32~34 min, 90%乙腈;34~35 min, 90%~3%乙腈。在此条件下, 各色谱峰分离良好, 色谱图见图4。
 
 图4 3种成分对照品 (A) 及供试品 (B) 的UPLC图Fig.4 UPLC of three ingredients of reference and test sample
图4 3种成分对照品 (A) 及供试品 (B) 的UPLC图Fig.4 UPLC of three ingredients of reference and test sample   下载原图
 
2.2.2 混合对照品溶液制备
分别取适量的黄芩苷、芍药苷、栀子苷对照品, 精密称定, 用甲醇分别配制成质量浓度为388.8、209.0、268.0μg/mL的混合对照品溶液。
 
2.2.3 供试品溶液及阴性样品溶液制备
称定止动颗粒粉末0.5 g及阴性样品0.5 g, 分别置于具塞锥形瓶中, 加入40%甲醇50 mL, 称定质量, 超声15 min, 放冷, 补足减失的质量, 摇匀, 14 100 r/min离心10 min, 上清液用0.22μm微孔滤膜滤过, 取续滤液即得供试品溶液和阴性样品溶液。
 
2.2.4 专属性考察
分别取空白溶剂、供试品和阴性供试品溶液, 按“2.2.1”项下方法分别进样分析, 验证专属性。由图5可见黄芩苷、芍药苷、栀子苷成分峰无其他杂峰干扰。
 
 图5 3种成分专属性对比色谱图Fig.5 Specificity comparison chromatograms of three constituents
图5 3种成分专属性对比色谱图Fig.5 Specificity comparison chromatograms of three constituents   下载原图
 
2.2.5 线性关系考察
分别从质量浓度为388.8、209.0、268.0μg/mL的黄芩苷、芍药苷、栀子苷混合对照品溶液中精密移取5 m L, 用甲醇于10 m L量瓶中进行倍比稀释, 得6个质量浓度的系列混合对照品溶液。按“2.2.1”项下色谱条件分别进样分析, 记录峰面积, 以对照品质量浓度为横坐标 (X) , 峰面积为纵坐标 (Y) , 用最小二乘法进行线性回归, 以计算线性方差和相关系数 (r) 。得回归方程分别为黄芩苷Y=24 205 475.7 X+15 295.1, r=0.999 9, 线性范围12.15~388.80μg/m L;栀子苷Y=10 571 885.8X+204 853, r=0.999 7, 线性范围6.52~209.00μg/mL;芍药苷Y=7 215 471.9 X+8 162.8, r=0.999 9, 线性范围8.38~268.00μg/mL。
 
2.2.6 精密度试验
精密吸取对照品溶液, 按“2.2.1”项下方法连续进样6针, 记录峰面积, 测得黄芩苷、栀子苷、芍药苷RSD分别为0.14%、0.20%、0.39%, 表明仪器精密度良好。
 
2.2.7 稳定性试验
取供试品溶液分别于0、8、16、24、32、46 h, 按“2.2.1”项下液相方法分别进样检测, 记录峰面积, 测得黄芩苷、栀子苷、芍药苷RSD分别为0.56%、0.23%、1.81%;表明供试品溶液在46 h内稳定性良好。
 
2.2.8 重复性试验
取6份0.5 g止动颗粒样品, 按“2.2.3”项下方法配制供试品溶液。按“2.2.1”项下液相方法进样分析, 记录峰面积, 计算黄芩苷、栀子苷、芍药苷质量分数平均值分别为8.68、8.51、7.60 mg/g, RSD分别为0.60%、0.55%、0.61%, 表明该方法重复性良好。
 
2.2.9 加样回收率试验
取9份止动颗粒样品0.25g, 精密称定, 分别置于量瓶中, 分别按0.5∶1、1∶1、1.5∶1的低、中、高比例加入混合对照品溶液, 平行3份, 加入适量40%甲醇, 超声处理30 min (功率500 W, 频率40 kHz) , 冷却至室温, 加40%甲醇定容, 摇匀, 取适量, 14 100 r/min离心10 min, 上清液用0.22μm微孔滤膜滤过, 按“2.2.1”项下液相方法进样分析, 计算加样回收率。结果黄芩苷、栀子苷、芍药苷平均回收率分别为100.98%、100.49%、100.55%, RSD分别为3.04%、0.60%、2.73%。
 
2.2.1 0 耐用性考察
取3份0.5 g止动颗粒样品, 按“2.2.3”项下方法配制供试品溶液。按“2.2.1”项下液相方法进样分析, 记录峰面积, 考察不同体积流量 (0.28、0.30、0.32 mL/min) 定量测定结果, 计算黄芩苷、栀子苷、芍药苷质量分数平均值分别为8.43、8.61、7.20 mg/g, RSD分别为0.89%、0.58%、2.81%。考察不同柱温 (30、35、40℃) 定量测定结果, 计算黄芩苷、栀子苷、芍药苷质量分数平均值分别为8.51、8.60、7.21 mg/g, RSD分别为1.75%、0.49%、2.76%。
 
2.2.1 1 样品含量测定
取11批样品, 按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液, 平行2份, 在“2.2.1”项色谱条件下测定, 结果见表2。
 
表2 3种成分含量测定结果 (n=2) Table 2 Results of content determination of three constituents (n=2)     下载原表
 
 表2 3种成分含量测定结果 (n=2) Table 2 Results of content determination of three constituents (n=2)
3 讨论
在供试品制备方法的考察中, 本研究分别对不同提取溶剂及其比例 (甲醇、10%甲醇、40%甲醇、70%甲醇、40%乙醇、乙醇) , 不同提取方式 (超声、热回流) 和不同提取时间 (15、30、45 min) 进行了考察, 10%甲醇超声15 min使指纹图谱信息更完整, 最终确定此为指纹图谱的供试品制备方法, 后经考察40%甲醇时黄芩苷量最高, 故最终确定40%甲醇超声15 min为含量测定的供试品制备方法。
 
在指纹图谱色谱分析中, 比较了止动颗粒在甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.2%甲酸水的整体洗脱情况, 乙腈-0.1%甲酸水分离效果最好, 峰形对称, 可与相邻色谱峰达到完全基线分离, 基线较平, 综合考虑, 最终确定乙腈-0.1%甲酸水为本实验流动相。比较了25、30、40℃, 在40℃下能够分离出更多的色谱峰, 使指纹图谱更完全;考察了不同体积流量0.35、0.30、0.25 mL/min对止动颗粒样品分离的影响, 0.30 mL/min下峰形较窄, 有更多的色谱峰信息;故选择在40℃, 0.30 mL/min条件下对止动颗粒样品进行洗脱。
 
利用UPLC/DAD对止动颗粒样品在190~400nm下进行紫外全波长扫描, 254 nm下色谱峰数最多, 且均有较好吸收, 尽可能地反映了指纹图谱有效信息, 故选择254 nm为止动颗粒指纹图谱检测波长。黄芩苷的最大吸收波长是280 nm, 栀子苷及芍药苷在240 nm有较好吸收, 响应较高, 最终选择240、280 nm进行含量测定。
 
在共有峰化学成分指认中, 8、9、10号峰均得到了m/z 571的分子离子峰, 与成分数据库比对, 推测3者互为白杨素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷异构体。3者均得到相同的特征碎片峰, 且8号峰与9号峰的色谱行为符合文献报道[19,20]中的白杨素-6-C-α-L-阿拉伯吡喃糖-8-C-β-D-葡萄糖苷和白杨素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷的色谱行为, 因此判断8号峰为白杨素-6-C-α-L-阿拉伯吡喃糖-8-C-β-D-葡萄糖苷, 9号峰为白杨素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷, 10号峰响应很低, 分子离子峰以及碎片离子信息与8、9号峰相同, 因此推断其为白杨素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷异构体。13号与14号峰具有相同的分子离子峰以及碎片信息, 通过与成分信息数据库比对, 并和文献报道[19,20]比对碎片信息, 推断两者为千层纸素A-7-O-葡萄糖醛酸苷或汉黄芩苷。并且13号与14号峰色谱行为符合文献中千层纸素A-7-O-葡萄糖醛酸苷和汉黄芩苷的色谱行为, 因此判断13号峰为千层纸素A-7-O-葡萄糖醛酸苷, 14号峰为汉黄芩苷。
 
4 结论
本实验建立的UPLC指纹图谱和3种成分的含量测定, 有效地反映了中药复方制剂止动颗粒的定性特征和定量信息。从止动颗粒指纹图谱共有峰中筛选了16个峰面积占比较高, 较稳定的成分峰作为共有峰, 与标准图谱的相似度大于0.98。采用UPLC-Q-TOF-MS联用技术对止动颗粒中共有峰化学成分进行鉴定, 指认了分别来自于白芍、栀子、黄芩、醋五味子的16个特征成分。11批制剂中黄芩苷为7.46~12.40 mg/g, 栀子苷为7.01~13.27 mg/g, 芍药苷为7.68~12.76 mg/g, 采用多波长梯度洗脱UPLC法对止动颗粒中的黄芩苷、栀子苷、芍药苷同时进行测定, 方法准确可靠, 可为该制剂制定新的检测方法。本实验表明了指纹图谱技术、UPLC多波长检测技术以及液质联用技术有效用于中药复方的质量控制, 为全面提升止动颗粒质量标准提供依据。

畅志文化期刊网,一个专业的论文发表,期刊发表,著作出版,课题等评职称相关平台。

文章名称:止动颗粒UPLC指纹图谱建立及3种成分测定

文章地址:www.sjzjkl.com/lunwenjianshang/_yi_/1405.html

内容来自网络-如有侵权,请告知删之

上一篇:复方石韦片HPLC指纹图谱的建立及其在制剂过程中的应用 下一篇:栀子苷乳剂的制备工艺及质量评价

还有问题,免费咨询专业人员

没有问题了,我想发稿或出版

选择服务:

作者姓名: *

联系电话: *

留言备注: *

咨询部:

发表部:

在线客服

客服电话:17600057161

投稿邮箱:71712724@qq.com

QQ:71712724
QQ:71712724

咨询部:

发表部: