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金银花与山银花体外印迹等效性的研究

分类:(一) 发表时间:2019-08-25

“印迹等效性”是指二者具有不同化学结构而体现相同 (似) “印迹模板”作用规律的现象, 临床上则表现为异质等效, 即不同物质产生相同作用效果的现象。金银花和山银花在我国资源丰
“印迹等效性”是指二者具有不同化学结构而体现相同 (似) “印迹模板”作用规律的现象, 临床上则表现为异质等效, 即不同物质产生相同作用效果的现象。金银花和山银花在我国资源丰富, 药用历史悠久。二者原同属金银花, 《中国药典》2005年版将其分列。至此, 南北“两花”纷争开始上演, 纷争表象看似是正本清源, 然实质却是中药异质等效规律的求证。 金银花主产于山东、河南等北方种植区, 山银花主要分布在湖南、四川、广东等南方种植区[1], 且二者的外观性状也存在较大区别[2,3]。除此以外, 金银花和山银花物质成分种类及含量亦不尽相同, 从现有文献统计, 在化学成分组成方面, 金银花较山银花含有更丰富的环烯醚萜类和黄酮类化合物, 山银花较金银花含有更为丰富的三萜皂苷类化合物。在各类化学成分含量方面也存在明显差异[4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16], 山银花中绿原酸类化合物含量明显高于金银花, 金银花中木犀草苷、芦丁、忍冬苷、木犀草素-7-O-β-D-半乳糖苷含量远高于山银花。例如, 山东平邑金银花中木犀草苷质量分数为0.073 9%, 而湖南怀化的山银花中没有检测到木犀草苷, 重庆秀山的山银花绿原酸质量分数高达9.03%, 远高于山东平邑金银花中绿原酸4.08%的含量[17,18]。在微量元素方面, 金银花中铁 (Fe) 与镍 (Ni) 含量高于山银花, 而山银花中锰 (Mn) 含量高于金银花[19]。尽管金、山银花在地域分布、外观形态、药效物质种类和含量上存在差异, 但两者在性味与归经、功能与主治甚至用法与用量中均为一致, 这点在中医临床长期实践过程及药典中可得到充分证实[20]。然而为何会产生这种现象, 为何拥有不同种类、不同数量化学成分的2味中药, 在临床上却能产生相同的治疗效果。不难看出, 金银花和山银花的药理作用除了遵循传统的药理学作用规律外, 还应有特殊作用规律即异质等效规律, 也就是中药多成分所产生的药理综合作用是诸成分印迹模板对人体印迹作用的结果, 具体可用超分子印迹模板理论来阐明。 印迹模板理念来源于Fischer酶与底物作用的锁钥模型以及Pauling的抗体形成学说, 类似于药理学经典的受体-配体理论, 能够用于解释受体-配体理论。但与其又存在差异, 是指以特定模板分子为客体分子, 寻找及制备出对该客体分子具有特异选择性主体分子的过程, 属于超分子化学中主客体化学研究范畴, 能体现自组织、自组装、自识别与自复制的特点[21,22,23,24,25,26,27]。超分子印迹模板概念是化学上的分子结构概念, 是在空间结构和结合位点上能完全匹配的模板物, 对中药成分来说既是其分子结构的空间活性结构, 也可以说是活性原子团的空间排列点阵, 能从化学物质的本源上说明主客体分子 (在一定程度下是受体-配体理论) 的普遍作用规律。例如, 哌替啶、吗啡、美沙酮、喷他佐辛、芬太尼等均可与脑啡肽竞争性结合作用于大脑阿片受体, 起到同样的中枢镇痛作用, 然而这众多镇痛药的结构与脑啡肽的结构相差千里[28]。这就说明产生同样的药理作用可以是不同的物质结构, 因此单用受体-配体、结构-配体理论不能做深层次解析, 自然只能将吗啡肽受体的3点结合抽象成印迹模板的空间结构表达。且大量的生物超分子化学表明, 来源于动植物的中药是一个巨大的超分子体系, 是自然界分子社会按印迹模板自主作用的结果[29]。因此, 对于金银花和山银花的异质等效现象只能用高于经典的构效关系的超分子印迹模板理论来阐述其所在核心之所在:不同物质可以相同印迹模板作用于相一致印迹模板的病证, 而这种印迹模板的作用特征可以通过体外的印迹交叉实验来进行验证。 1 实验原理 基于中药超分子理论, 中药主客体分子的分离实质即从巨复的中药超分子体系中洗脱模板小分子保留母体印迹模板的过程, 包括中药成分提取和溶出。因此, 通过对金银花和山银花成分的充分提取和溶出即可实现其超分子主客体分子分离的过程。本实验在对金银花和山银花主客体分子进行分离后, 可得到药渣 (主体分子) 及金银花和山银花提取液 (客体分子) 。因菊花以花入药, 且具有清热解毒的作用, 所以其药渣被选为本实验的阴性对照。同时在金银花、山银花单味药的基础上增加了双黄连与银翘散处方, 选其水提取液参与实验。为验证金银花和山银花印迹等效性, 探讨主体分子对客体分子的选择吸附性, 使金银花、山银花、菊花药渣与金银花、山银花、双黄连 (金银花) 、双黄连 (山银花) 、银翘散 (金银花) 、银翘散 (金银花) 水提液进行选择性吸附, 再采用HPLC法测定吸附前后水提液的指纹图谱。 统计矩原理为非房室模型分析方法, 可通过总量零阶矩 (AUC) 、总量一阶矩 (MRT) 、总量二阶矩 (VRT) 对中药及其复方指纹图谱进行分析。其中零阶矩表示血药浓度-时间曲线下面积, 即整个指纹图谱的峰面积和;一阶矩为平均驻留时间, 即整个指纹图谱所有峰重心的位置;二阶矩为平均驻留时间的方差, 即指纹图谱中每个峰与峰重心的距离。较之其他指纹图谱分析方法, 该法具有抗干扰性、加和性、偶联性的特点[30,31,32]。一直以来, 本团队致力于将总量统计矩法运用于中药及其复方的指纹图谱分析中, 也取得了较好的成效。贺福元等[33]采用HPLC法对不同产地大黄指纹图谱进行测定, 运用总量统计矩法对其进行分析, 发现通过一阶矩可以定性识别大黄;胡超等[34]通过总量统计矩法对不同批次片仔癀指纹图谱进行分析, 所建立的片仔癀指纹图谱重复性好、准确度高、特征性强。除此以外, 杨岩涛等[35]、周晋等[36,37]、谢相贵等[38]也对其进行了研究, 证实了该法可对中药及其复方指纹图谱进行定性定量分析, 准确度较好。 本实验通过计算实验后所有指纹图谱一阶矩、原客体分子与被不同主体分子吸附后相应客体分子指纹图谱一阶矩差值, 比较相同客体分子被不同主体分子吸附后其指纹图谱的变化情况。以此来探讨3种主体分子是否存在相同印迹模板, 从而对金银花和山银花的印迹模板等效性进行评价。 2 试药与仪器 2.1 试药与试剂 金银花Lonicerae Japonicae Flos (忍冬科忍冬属植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花) 、菊花Chrysanthemi Flos (菊科菊属植物菊Chrysanthemum morifolium Ramat.的干燥头状花序) 、双黄连处方[金银花、黄芩Scutellariae Radix (唇形科黄芩属植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根) 、连翘Forsythiae Fructus (木犀科连翘属植物连翘Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl的干燥果实) ]、银翘散处方[金银花、连翘、薄荷Menthae Haplocalycis Herba (唇形科薄荷属植物薄荷Mentha haplocalyx Briq.的干燥地上部分) 、荆芥Schizonepetae Herba (荆芥Schizonepeta tenuifolia Briq.的干燥地上部分) 、淡豆豉Sojae Semen Praeparatum (豆科大豆属植物大豆Glycine max (L.) Merr.的成熟种子的发酵加工品) 、牛蒡子Arctii Fructus (菊科牛蒡属植物牛蒡Arctium lappa L.的干燥成熟果实) 、桔梗Platycodonis Radix (桔梗科桔梗属植物桔梗Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC.的干燥根) 、淡竹叶Lophatheri Herba (禾本科淡竹叶属植物淡竹叶Lophatherum gracile Brongn.的干燥茎叶) ]。以上药材及处方中药材均委托湖南中医药大学第一附属医院药剂科定点采购, 山银花Lonicerae Flos (灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.的干燥花蕾或带初开的花) 购于湖南省隆回县, 并由湖南中医药大学药学院中药鉴定教研室石继连副教授按《中国药典》2015年版一部有关项下进行鉴别, 结果均为正品。乙腈为色谱纯, 水为自制超纯水。 2.2 仪器 Waters1525 Binary HPLC Pump、Waters2489 UV/Visible Detector、Breeze工作站, 美国Waters公司;RE-200B型旋转蒸发仪, 巩义市予华仪器有限责任公司;SHB-IIIAS型循环水式真空泵、ZDHW型调温电热套, 北京中兴伟业仪器有限公司;YP-B10001型电子天平, 上海光正医疗仪器有限公司;DFY-400摇摆式高速中药粉碎机, 温岭市林大机械有限公司;DZF-6050真空干燥箱, 上海精宏实验设备有限公司;SK3300H型超声清洗器, 上海科寻超声仪器有限公司;TS-A脱色摇床, 金坛市中大仪器厂;移液枪, 雪蓓医疗设备有限公司。 3 方法 3.1 色谱条件 色谱柱为Ultimate AQ-C18柱 (250 mm×4.6mm, 5μm) ;流动相为0.4%磷酸水溶液-乙腈, 梯度洗脱:0~5 min, 5%~8%乙腈;5~25 min, 8%~20%乙腈;25~35 min, 20%~22%乙腈;35~45min, 22%~30%乙腈;45~50 min, 30%~36%乙腈;体积流量1.0 m L/min;进样量10μL;检测波长238 nm;柱温30℃。各成分理论塔板数不低于3 000, 分离度良好。 3.2 主客体分子的制备 称取金银花和山银花及菊花各适量, 分别粉碎并过40目筛, 各取药粉20 g置于250 mL锥形瓶中, 加超纯水200 m L, 超声提取30 min后滤过。滤渣加超纯水200 mL, 重复提取7次;滤渣于真空干燥箱中60℃下烘干后, 轻轻捻碎, 再过40目筛。最终得到的3种药渣粉末为3种主体分子。3种主体分子图见图1。 图1 3种主体分子图Fig.1 Three host molecules 图1 3种主体分子图Fig.1 Three host molecules 下载原图 称取金银花和山银花各20 g, 置于500 m L圆底烧瓶中, 加水300 mL, 回流提取2次, 每次1 h。滤过, 滤液经旋转蒸发仪浓缩, 后水浴蒸干成金银花、山银花浸膏。称取双黄连处方药材, 加20倍超纯水煎煮2次, 其后滤过, 浓缩, 水浴蒸干成双黄连 (金银花) 浸膏;将处方中金银花换成山银花, 重复上述操作, 得双黄连 (山银花) 浸膏。同理, 银翘散处方药材重复双黄连处方操作, 分别制备含金银花和山银花银翘散处方提取液。最终得到的6种提取液则是6种客体分子。 3.3 主客体分子选择性吸附实验 称取金银花和山银花及菊花干燥药渣粉末各6份, 每份0.5 g, 分别置于100 mL锥形瓶中。 称取金银花、山银花、双黄连 (金银花) 、双黄连 (山银花) 、银翘散 (金银花) 、银翘散 (山银花) 浸膏各1.2 g于烧杯, 加超纯水200 mL溶解。将相同水溶液分别加入到3种不同药渣锥形瓶中, 每份50 m L。将主客体分子混合后, 锥形瓶置于摇床上振摇12 h。收集12 h后锥形瓶中溶液, 经0.45μm微孔滤膜滤过, 与未经吸附的提取液一起, 采用HPLC法检测。 3.4 方法学考察 3.4.1 精密度试验 精密称取绿原酸对照品适量, 置于棕色量瓶中, 加甲醇配制成0.078 mg/mL的对照品溶液。取绿原酸对照品溶液, 按上述色谱条件进样6次, 每次10μL, 检测指纹图谱, 其峰面积RSD为0.56%, 表明仪器的精密度良好。 3.4.2 稳定性试验 取金银花水溶液, 放置0、2、4、8、12、24 h, 按上述色谱条件分别进样10μL, 检测指纹图谱, 主要色谱峰的峰面积RSD为1.34%, 表明供试品溶液在24 h内稳定。 3.4.3 重复性试验 取金银花药渣6份, 每份0.5 g。取山银花浸膏1.8 g, 溶于300 mL超纯水中。将山银花水溶液加入金银花药渣中, 每份50 m L, 于摇床振摇吸附12 h。取吸附后的山银花水提液进样, 每次10μL, 其指纹图谱一阶矩的RSD为0.28%, 表明该方法重复性较好。 3.4.4 加样回收率试验 取已知质量浓度金银花水溶液, 精密加入一定量绿原酸对照品溶液, 配成6份溶液。按“3.3”项下进行吸附实验, 后按上述色谱条件进样, 每次10μL, 计算加样回收率, 其平均加样回收率为101.43%, RSD为2.46%, 表明该方法准确可靠。 4 结果 4.1 样品指纹图谱 主客体分子选择性吸附指纹图谱见图2, 是同一客体分子被不同主体分子吸附后的指纹图谱。 4.2 指纹图谱总量一阶矩及t检验 通过指纹图谱总量统计矩公式计算, 求得每一份样品指纹图谱的一阶矩及其差值, 如表1、2所示。 分别对以金银花药渣组、山银花药渣组、金银花与菊花药渣组、山银花与菊花药渣组为主体分子的组别一阶矩差值进行t检验, 结果P1=0.94>0.05、P2=0.02<0.05、P3=0.04<0.05 (其中P1为金银花与山银花药渣组比较结果;P2为金银花与菊花药渣组比较结果;P3为山银花与菊花药渣组比较结果) 。由实验结果得知, 所有提取液分别被金、山银花药渣吸附后, 其一阶矩无显著性差异。而被菊花药渣吸附后, 与被金、山银花药渣吸附后相比均存在显著性差异。也就是说, 金银花与山银花主体分子对6种客体分子的吸附性无显著性差别, 即金银花和山银花具有相同 (似) 的印迹模板;而金银花与菊花主体分子、山银花与菊花主体分子对6种客体分子的吸附性均存在显著性差别, 即金、山银花二者与菊花的印迹模板均不相同, 这与金银花和山银花临床疗效相同却区别于菊花的现象相符。 图2 6种提取液 (客体分子) 与3种药渣 (主体分子) 选择性吸附指纹图谱Fig.2 Fingerprints of selective adsorption between six extracts (guest molecules) and three drug residues (host molecules) 图2 6种提取液 (客体分子) 与3种药渣 (主体分子) 选择性吸附指纹图谱Fig.2 Fingerprints of selective adsorption between six extracts (guest molecules) and three drug residues (host molecules) 下载原图 S1-提取液原液S2-山银花药渣S3-金银花药渣S4-菊花药渣S1-original extract S2-Lonicerae Japonicae Flos residue S3-Lonicerae Flos drug residue S4-Chrysanthemi Flos drug residue 表1 主、客体选择性吸附后一阶矩参数Table 1 First moment parameters of selective adsorption between host and guest molecules 下载原表 表1 主、客体选择性吸附后一阶矩参数Table 1 First moment parameters of selective adsorption between host and guest molecules 表2 主、客体选择性吸附后一阶矩参数差值Table 2 First moment parameters difference of selective adsorption between host and guest molecules 下载原表 表2 主、客体选择性吸附后一阶矩参数差值Table 2 First moment parameters difference of selective adsorption between host and guest molecules 5 分析与讨论 运用中药超分子印迹模板理论对金银花和山银花异质等效现象进行解释:中药与人体作为巨复超分子体系, 二者具有相同的超分子印迹聚合物空穴识别位点, 而有效成分群作为客体分子可通过特定的连接方式与中药或人体中主体分子识别位点相结合, 进而起到治疗作用, 这就是中药与人体作用的本质, 也便是中药药效的产生机制。 在中药与人体的作用过程中, 因为仅仅存在有效成分群与空穴识别位点活性部位的相互连接、相互作用, 因此尽管不同中药中化学成分的种类及其含量并不一致, 但只要其有效成分群拥有相同的活性部位、活性官能团, 便可以起到相同的药效作用, 这是有别于传统点-点结合构效关系的印迹模板立体空间构型关系。即金、山银花具有相同 (似) 印迹模板是其产生相同药效的前提, 这也便是金银花和山银花异质等效现象的实质。 本实验运用超分子印迹模板的自主作用规律对金银花和山银花纷争实质进行探讨, 提出了运用中药材超分子印迹模板作用, 结合中药定量谱学来解决金银花和山银花异质等效问题。本实验中主体分子包括金银花药渣、山银花药渣、菊花药渣3种, 客体分子为金银花、山银花、双黄连 (金银花) 、双黄连 (山银花) 、银翘散 (金银花) 、银翘散 (山银花) 水提液。 以菊花药渣为阴性对照, 探讨金银花和山银花主体分子对金银花和山银花客体分子的选择吸附能力, 希望为研究证明金银花和山银花拥有相同 (似) 印迹模板提供理论基础。实验结果表明, 金银花和山银花主体分子对客体分子的吸附效果无显著性差别, 与菊花主体分子形成对比。本实验反映了金银花和山银花之间印迹模板的相似性, 证明了金银花和山银花具有印迹等效性, 为金银花和山银花异质等效规律的探证提供了新的方法, 同时为建立现代中药饮片品种的确定方法, 促进中药材产业的发展奠定理论和实验基础。

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