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Box-Behnken响应面法优化彝药蜜酒同制大黄工艺

分类:(一) 发表时间:2019-08-25

大黄, 彝药名冻巴、勒乌, 是我国传统中、彝医用药材, 汉医和彝医文献均有记载, 其药用植物来自于蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.、唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim.ex Baff.或药用大黄Rheum
大黄, 彝药名冻巴、勒乌, 是我国传统中、彝医用药材, 汉医和彝医文献均有记载, 其药用植物来自于蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.、唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim.ex Baff.或药用大黄Rheum officinale Baill.的干燥根及根茎[1]。大黄中主要活性成分为蒽醌类化合物及其衍生物如芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚[2,3]等, 其药理作用主要有泻下、止血、抗病原微生物、抗炎、抗肿瘤、保护心脑血管、保肝及抗衰老[4,5,6,7,8,9,10,11,12]。大黄性味苦寒, 归脾、胃、大肠、肝、心包经[1], 常用于治疗便秘、黄疸、消化道出血和溃疡等症[4,13,14]。大黄在彝医中还用于治疗胎盘不下、疟疾、冻伤及泡水服消暑防病等, 是彝医的独特用法[13,15]。蜜酒同制大黄是彝药特色炮制品, 经蜜酒制及发酵后, 可清上焦血分热毒, 减缓大黄的峻下作用, 可治疗目赤咽痛、清胃肠湿热和消暑等[16]。 彝药蜜酒同制大黄文献收载有多种炮制方法, 较为常用及简便的一种为将蜂蜜炼老, 大黄研粉, 兑入黄酒与药粉, 捣成泥状, 共蒸2 h左右至透, 搓成直径4 cm的长条, 晒至7成干, 闷10 d至内外湿润一致时, 切成片晾干。每100 kg冻巴 (大黄) , 用炼老蜂蜜40 kg, 黄酒45 kg[16,17]。该工艺与2005年版《河南省中药饮片炮制规范》中记载的清宁片炮制工艺[18]较为相似, 但仍有区别。工艺对比见表1。 表1 清宁片与蜜酒同制大黄的炮制工艺对比Table 1 Comparison on processing technology between Qingning Tablets and honeyed wine rhubarb 下载原表 表1 清宁片与蜜酒同制大黄的炮制工艺对比Table 1 Comparison on processing technology between Qingning Tablets and honeyed wine rhubarb 作为一种传统彝药炮制特色的工艺和品种, 蜜酒同制大黄在中、彝药文献中的工艺研究甚少, 其炮制规范及质量标准方面的研究亦未见报道。文献中存在部分关键工艺参数尚不明确, 如粉碎粒度、干燥温度、闷润温度等, 含水量等为经验指标, 蒸制时长在不同文献中有一定差异[16,17], 不利于蜜酒同制大黄的规范化生产和质量控制。根据民族药中药的质量评价应以多个质量标志物 (Q-marker) 相关成分为指标[19], 本研究拟使用单因素考察结合Box-Behnken响应面 (BBD-RSM) 设计, 以蜜酒同制大黄中游离蒽醌含量、总蒽醌含量、浸出物含量的总评归一值 (OD) [20]为评价指标, 优化蜜酒同制大黄的最佳炮制工艺。 1 仪器与材料 Waters 2695/2996型高效液相色谱仪, 包括真空脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱, UV2489检测器, Empower 2.0工作站, 美国Waters公司;Diamonsil C18 (150 mm×4.6 mm, 5μm) 色谱柱, 大连依利特分析仪器有限公司;ESJ200-4型万分之一电子天平, 沈阳龙腾电子有限公司;BT25S型十万分之一电子天平, 北京赛多利斯科学仪器有限公司;SENCO-R系列W201恒温水浴锅, 上海申生科技有限公司;KQ5200E型超声波清洗器, 昆山超声仪器有限公司;DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱, 上海一恒科学仪器有限公司。 对照品芦荟大黄素 (批号120425) 、大黄酸 (批号131220) 、大黄素 (批号120210) 、大黄酚 (批号130522) 和大黄素甲醚 (批号131014) , 质量分数均≥98%, 均为成都普菲德有限公司产品。流动相甲醇为色谱纯, Fisher公司, 批号171223;磷酸为分析纯, 质量分数≥85.0%;提取用甲醇为分析纯, 质量分数≥99.5%, 购于成都市科龙化工试剂厂;水为自制超纯水, Thremo Barnstead Gen Pure UV/UF小型超纯水系统制备。大黄药材采自四川省阿坝州黑水县, 经中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所黄林芳教授鉴定为掌叶大黄Rheum palmatum L., 蜂蜜为四川省阿坝州黑水县阿坝中蜂蜂蜜, 黄酒为市售品。 2 方法与结果 2.1 蜜酒同制大黄的制备 取大黄适量, 粉碎, 过100目筛, 取细粉100 g, 兑入炼老蜂蜜40 g, 黄酒45 g, 混合均匀, 捣成泥状, 蒸2 h至透, 搓成直径4 cm的长条, 50℃烘至含水量40%, 置密封容器内, 于30℃闷润10 d, 至内外湿润一致时, 取出, 切成3~5 mm厚片, 晾干[17]。 2.2 游离蒽醌和总蒽醌的定量测定[21,22] 2.2.1 色谱条件 Hypersil C18色谱柱 (250 mm×4.6 mm, 5μm) ;流动相甲醇-0.1%磷酸水溶液 (85∶15) , 柱温30℃, 进样量10μL, 检测波长254 nm, 体积流量1.0 mL/min。按上述色谱条件检测蜜酒同制大黄中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的量, 游离蒽醌的量、总蒽醌的量分别以上述5种成分的总量计。混合对照品、游离蒽醌供试品、总蒽醌供试品色谱图见图1。 2.2.2 对照品溶液的制备 图1 混合对照品 (A) 、游离蒽醌供试品 (B) 、总蒽醌供试品 (C) 的HPLC图Fig.1 HPLC of mixed reference substance (A) , free anthraquinone test solution (B) , and total anthraquinone test solution (C) 图1 混合对照品 (A) 、游离蒽醌供试品 (B) 、总蒽醌供试品 (C) 的HPLC图Fig.1 HPLC of mixed reference substance (A) , free anthraquinone test solution (B) , and total anthraquinone test solution (C) 下载原图 1-芦荟大黄素2-大黄酸3-大黄素4-大黄酚5-大黄素甲醚1-aloe-emodin 2-rhein 3-emodin 4-chrysophanol 5-physcion 精密称取芦荟大黄素对照品0.28 mg、大黄酸对照品1.17 mg、大黄素对照品0.25 mg、大黄酚对照品0.55 mg、大黄素甲醚对照品0.18 mg, 加甲醇定容至10 m L量瓶中, 制成含芦荟大黄素0.028 mg/mL、大黄酸0.117 mg/mL、大黄素0.025 mg/mL、大黄酚0.055 mg/mL、大黄素甲醚0.018 mg/mL的混合对照品溶液。 2.2.3 供试品溶液的制备 (1) 游离蒽醌供试品溶液的制备:精密称定本品0.5 g, 置具塞锥形瓶中, 精密加入甲醇25 mL, 称定质量, 加热回流1 h, 放冷, 再称定质量, 用甲醇补足减失质量, 摇匀, 滤过, 取续滤液, 作为游离蒽醌供试品溶液。 (2) 总蒽醌供试品溶液的制备:精密称定本品0.15 g, 置具塞锥形瓶中, 精密加入甲醇25 mL, 称定质量, 加热回流1 h, 放冷, 再称定质量, 用甲醇补足减失质量, 摇匀, 滤过。精密量取续滤液5 mL, 置烧瓶中, 挥去溶剂, 加8%盐酸溶液10 mL, 超声处理2 min, 再加三氯甲烷10 mL, 加热回流1 h, 放冷, 置分液漏斗中, 用少量三氯甲烷洗涤容器, 并入分液漏斗中, 分取三氯甲烷层, 酸液再用三氯甲烷提取3次, 每次10 m L, 合并三氯甲烷液, 减压回收溶剂至干, 残渣加甲醇使溶解, 转移至10 mL量瓶中, 加甲醇至刻度。摇匀, 滤过, 取续滤液, 作为总蒽醌供试品溶液。 2.2.4 线性关系考察 精密吸取“2.2.2”项下对照品溶液, 按上述色谱条件依次进样2、6、10、14、18、22μL, 以进样量为横坐标 (X) , 峰面积为纵坐标 (Y) , 得到线性回归方程及相关系数 (r) 。芦荟大黄素Y=93 314 X-83 359, r=0.999 8, 进样量线性范围0.056~0.616μg;大黄酸Y=239 384 X-200 325, r=0.999 9, 进样量线性范围0.234~2.574μg;大黄素Y=109 566 X-87 979, r=0.999 9, 进样量线性范围0.050~0.550μg;大黄酚Y=267 322X-202 982, r=0.999 9, 进样量线性范围0.110~1.210μg;大黄素甲醚Y=56 763 X-52 006, r=0.999 9, 进样量线性范围0.036~0.396μg。 2.2.5 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液10μL, 连续进样6次, 计算芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚峰面积的RSD分别为0.98%、0.86%、0.37%、0.56%、0.39%, 表明仪器精密度良好。 2.2.6 稳定性试验 按“2.2.3”项下方法分别制备游离蒽醌供试品溶液和总蒽醌供试品溶液 (响应面实验中8号样品) , 分别于0、4、6、8、12、24 h进行HPLC测定, 计算得游离蒽醌供试品中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚峰面积的RSD分别为0.19%、0.32%、0.98%、0.25%、0.41%, 总蒽醌供试品中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚峰面积的RSD分别为0.37%、0.21%、0.27%、0.64%、0.82%, 结果表明, 游离蒽醌供试品溶液和总蒽醌供试品溶液在24 h内稳定性良好。 2.2.7 重复性试验 取同一炮制方法下的样品 (响应面实验中8号样品) , 依“2.2.3”项下游离蒽醌供试品溶液和总蒽醌供试品溶液的制备方法, 分别平行制样6份。分别精密量取10μL, 按前述色谱条件进样, 测定峰面积。计算得游离蒽醌供试品中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚质量分数的RSD分别为1.53%、0.87%、1.17%、0.91%、1.01%, 游离蒽醌供试品中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚峰质量分数的RSD分别为0.99%、1.01%、1.18%、1.24%、0.87%, 表明本方法重复性良好。 2.2.8 加样回收率试验 精密量取已知游离蒽醌含量的蜜酒同制大黄供试品溶液 (响应面实验中8号样品) 3份, 每份1 mL, 分别按供试品指标成分含量的80%、100%、120%精密加入一定量的混合对照品溶液 (芦荟大黄素0.065 mg/mL、大黄酸0.019mg/mL、大黄素0.037 mg/mL、大黄酚0.058 mg/mL、大黄素甲醚0.024 mg/mL) , 每个质量浓度平行3份, 按“2.2.1”项下色谱条件测定各指标成分的含量。总蒽醌供试品溶液的加样回收率试验同法操作。计算得到游离蒽醌供试品溶液中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的平均回收率分别为102.69%、104.13%、94.65%、95.13%、102.82%, RSD分别为1.86%、1.89%、1.39%、1.16%、1.36%;总蒽醌供试品溶液中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的平均回收率分别为97.82%、102.39%、99.45%、103.90%、101.76%, RSD分别为1.73%、1.90%、1.88%、1.35%、1.48%, 表明加样回收率良好。 2.3 浸出物的测定 精密称定本品2 g, 精密称定, 置250 mL锥形瓶中, 精密加水100 mL, 密塞, 称定质量, 静置1h, 连接回流冷凝管, 加热至沸腾, 并保持微沸1 h。放冷后, 取下锥形瓶, 密塞, 再称定质量, 用水补足减失质量, 摇匀, 用干燥滤器滤过, 精密量取滤液25 m L, 置已干燥至恒定质量的蒸发皿中, 在水浴上蒸干后, 于105℃干燥3 h, 置干燥器中冷却30 min, 迅速精密称定质量。以干燥品计算供试品中水溶性浸出物的含量。 2.4 水分的测定 按照《中国药典》2015年版水分测定法 (通则0832) 项下烘干法测定蜜酒同制大黄样品中的水分。精密称定蜜酒同制大黄样品2 g, 平铺于干燥至恒定质量的扁形称量瓶中 (厚度不超过5 mm) , 开启瓶盖在100~105℃干燥5 h, 将瓶盖盖好, 移置干燥器中, 放冷30 min, 精密称定, 再在上述温度干燥1 h, 放冷, 称定质量, 至连续2次称定质量的差异不超过5 mg为止。根据减失的质量, 计算供试品中的水分。 2.5 单因素试验 2.5.1 不同粉碎粒度 准确称取大黄药材100 g, 打粉, 分别过三号筛 (50目) 、五号筛 (80目) 、六号筛 (100目) 、七号筛 (120目) 、八号筛 (150目) , 按比例与黄酒、炼蜜混合, 固定其余条件, 考察不同粉碎粒度对蜜酒同制大黄中游离蒽醌含量、总蒽醌含量、浸出物含量的总评归一值 (OD) 的影响, 并结合炮制品的感官评价进行评分。OD值的计算采用Hassan方法对各指标成分的含量进行标准化转换, 使其表示为0~1的归一值 (d) , di= (YiYmin) / (Ymax-Ymin) 。其中, Yi为实测值, Ymin和Ymax分别指每一指标在不同次试验中测得的所有值中的最小值和最大值。根据公式OD= (d1d2d3…dk) 1/k (k为指标数) 求得OD值[20]。感官评分方法采用9人评分法 (4男5女, 20~25岁) , 从3个方面进行评分 (表2) 。由表3可知, 药材粉碎越细, OD值越高, 过100目筛后的细粉OD值差异不大, 在120目处达到最大值。同时, 随着粉碎粒度的增大, 其炮制成品的感官评分也随之增加, 在100目处达最大值, 此后呈下降趋势。因此, 结合OD值和炮制品感官评分, 确定粉碎粒度为过100目筛细粉。2.5.2不同蒸制时间准确称取大黄药材100 g, 固定其余条件, 考察不同蒸制时间1、2、3、4 h对蜜酒同制大黄中游离蒽醌含量、总蒽醌含量、浸出物含量的OD值的影响, 并结合炮制品的感官评价进行评分。由表4可知, 随着蒸制时间的增加, OD值亦呈增大趋势, 在3 h处达到最大值, 此后数值有所下降。表4同时显示, 随着蒸制时间的增加, 炮制品的感官评分同样趋于升高, 因此, 蒸制时间的水平选取2、3、4 h进行后续Box-Behnken试验考察。 表2 感官评分标准Table 2 Sensory evaluation criteria 下载原表 表2 感官评分标准Table 2 Sensory evaluation criteria 感官评分=a×25.0%+b×37.5%+c×37.5%sensory evaluation score=a×25.0%+b×37.5%+c×37.5% 表3 粉碎粒度对OD值及感官评分的影响Table 3 Effects of particle size on OD value and sensory evaluation score 下载原表 表3 粉碎粒度对OD值及感官评分的影响Table 3 Effects of particle size on OD value and sensory evaluation score 表4 蒸制时间对OD值及感官评分的影响Table 4 Effects of steaming time on OD value and sensory evaluation score 下载原表 表4 蒸制时间对OD值及感官评分的影响Table 4 Effects of steaming time on OD value and sensory evaluation score 2.5.3 不同闷润温度 准确取大黄药材100 g, 固定其余条件, 考察不同闷润温度24、27、30、33℃对蜜酒同制大黄游离蒽醌含量、总蒽醌含量、浸出物含量的OD值的影响, 并结合炮制品的感官评价进行评分。由表5显示, OD值随着温度的升高而逐渐增大, 但在30℃以后, OD值开始下降, 而感官评分的变化趋势也与OD值相同。此外, 温度过高可能产生霉变现象, 因此在后续Box-Behnken试验优化设计中, 选取27、30、33℃作为闷润温度的水平范围。 2.5.4 不同含水量 准确称取大黄药材100 g, 固定其余条件, 考察不同含水量30%、40%、50%、60%对蜜酒同制大黄中游离蒽醌含量、总蒽醌含量、浸出物含量的OD值的影响。并结合炮制品的感官评价进行评分。根据表6数据, OD值随着含水量的增大而升高, 在含水量达到40%之后, OD值逐渐下降。随着含水量的增加, 其炮制品的感官评分也增加, 在含水量50%时, 炮制品外观乌黑如漆有光泽, 弹性最佳, 感官评分最高。因此在进一步Box-Behnken试验优化设计中, 含水量的水平选取范围为30%~50%。 表5 闷润温度对OD值及感官评分的影响Table 5 Effects of storage temperature on OD value and sensory evaluation score 下载原表 表5 闷润温度对OD值及感官评分的影响Table 5 Effects of storage temperature on OD value and sensory evaluation score 2.6 Box-Behnken响应面法优化试验设计 2.6.1 试验设计与结果 在单因素实验的基础上, 选取蒸制时间 (A) 、闷润温度 (B) 、含水量 (C) 为考察因素, 以游离蒽醌 (Y1) 、总蒽醌 (Y2) 、浸出物 (Y3) 的OD值为评价指标进行Box-Behnken试验设计。各因素水平见表7。Box-Behnken试验设计方案和OD值数据见表7。 表6 含水量对OD值及感官评分的影响Table 6 Effects of moisture content on OD value and sensory evaluation score 下载原表 表6 含水量对OD值及感官评分的影响Table 6 Effects of moisture content on OD value and sensory evaluation score 2.6.2 模型拟合及显著性分析 使用Design Expert10.0软件, 将表7中各组指标成分的OD值数据进行多元回归拟合和二项式分析, 建立蜜酒同制大黄炮制工艺OD值对蒸制时间 (A) 、闷润温度 (B) 、含水量 (C) 的二次回归模型方程:OD=0.92+0.094A+0.061 B+0.257 C+0.094 AB+0.040 AC-0.031BC-0.15 A2-0.056 B2-0.48 C2。回归模型的方差分析结果见表8。 由表8可知, 拟合模型的P值小于0.01, 说明该模型极显著。失拟项的P值为大于0.05, 表明该模型拟合良好, 模型的残差可能是随机误差产生的。在1次项中, A、B、C均为显著项 (P<0.05) , 显著程度C>A>B, 说明含水量对响应值的影响最大, 蒸制时长其次, 闷润温度最末;2次项中, A2和C2为显著项, B2为不显著项, 说明闷润温度、含水量对响应值的影响是非线性的;交互项中, AB为显著项, AC、BC均为不显著项, 表明蒸制时长与闷润温度之间交互影响非常明显。模型的总决定系数r2=0.987 4, 调整系数r2adj=0.971 1, 表明该模型拟合程度高, 试验误差小, 可解释98.74%的试验数据变异性, 能够良好地反映蜜酒同制大黄中游离蒽醌 (Y1) 、总蒽醌 (Y2) 和浸出物 (Y3) 总含量的OD值和炮制过程中3个因素蒸制时间 (A) 、含水量 (B) 、闷润温度 (C) 之间的变化关系, 可以通过此模型对蜜酒同制大黄的炮制工艺进行分析和预测。 表7 实验设计及结果Table 7 Design and results of response surface 下载原表 表7 实验设计及结果Table 7 Design and results of response surface 表8 回归模型方差分析Table 8 Analysis and variance 下载原表 表8 回归模型方差分析Table 8 Analysis and variance P<0.05表示差异显著;P<0.01表示差异极显著P<0.05 significant difference;P<0.01 more significant difference 2.6.3 最优炮制工艺预测及试验验证比较 利用Design Expert 10.0软件拟合的蒸制时长 (A) 、闷润温度 (B) 、含水量 (C) 3个因素的交互作用对OD值的影响见图2。 根据软件分析结果, 计算及预测二次回归方程, 得到蜜酒同制大黄的最佳炮制工艺为蒸制时间3.62h, 闷润温度32.61℃, 含水量42.78%, 粉碎粒度100目。预测游离蒽醌含量为0.64%, 总蒽醌含量为1.82%, 浸出物含量为31.03%。考虑到实际操作的便利, 调整工艺为蒸制时间3.5 h, 闷润温度33℃, 含水量43%, 粉碎粒度100目。以上述条件平行3次炮制蜜酒同制大黄, 进行工艺验证试验。结果见表9。结果显示, 通过优化后的工艺条件炮制的蜜酒同制大黄, 游离蒽醌、总蒽醌与浸出物含量均有所增加, 游离蒽醌平均值为0.66%, RSD为2.30%;总蒽醌平均值为1.85%, RSD为1.90%;浸出物含量平均值为31.16%, RSD为0.25%;与预测值的偏差率分别为2.53%、1.03%和0.29%。实测值数据与预测值基本一致, 说明该实验拟合的数学回归模型是可靠的, 蜜酒同制大黄的炮制工艺成功得到了优化。 图2 蒸制时长 (A) 、闷润温度 (B) 和含水量 (C) 的交互作用响应面图Fig.2 Response surface diagram of steaming time (A) , storage temperature (B) , and moisture content (C) for their mutual interaction 图2 蒸制时长 (A) 、闷润温度 (B) 和含水量 (C) 的交互作用响应面图Fig.2 Response surface diagram of steaming time (A) , storage temperature (B) , and moisture content (C) for their mutual interaction 下载原图 表9 验证试验结果 (n=3) Table 9 Results of verification experiments (n=3) 下载原表 表9 验证试验结果 (n=3) Table 9 Results of verification experiments (n=3) 3 讨论 《中国药典》2015年版中, 将芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚作为评价指标, 用以测定大黄及其炮制品的总蒽醌含量及游离蒽醌含量, 同时也测定了水溶性浸出物的含量。本研究设计以上述3种成分含量的OD值为指标进行含量测定, 同时外观品质是评价炮制品质量不可或缺的一环, 设计感官评价得分与含量测定相结合, 能更加全面评价蜜酒同制大黄的品质。 经过前期试验考察, 发现炮制过程中蜜酒同制大黄的粉碎粒度、蒸制时间、烘后的含水量、密封期间的闷润温度及闷润时间5个因素对炮制品的活性成分含量和外观品质均会产生较大的影响。研究结果表明, 粉碎粒度及闷润时间的改变, 对炮制品的外观品质的影响较大, 而对活性成分的含量影响较小。因此选择活性成分含量较高同时炮制品外观成色更好的工艺条件:粉碎粒度为过100目筛细粉, 闷润时间10 d。闷润时间与原地方炮制规范记载的闷润时间一致, 为地方炮制规范记载的工艺提供了科学依据[13,17]。 研究结果还表明蒸制时长、闷润温度、含水量对炮制品的影响主要体现在活性成分的含量差异上, 因此在保证外观品质符合要求的前提下, 进一步筛选最佳工艺条件。原工艺存在蒸制时间不统一, 7成干需客观量化, 闷润温度未明确等问题, 因此进一步设计Box-Behnken响应面试验, 优选出粉碎粒度100目筛, 蒸制时间3.5 h, 闷润温度33℃, 含水量43%的蜜酒同制大黄最佳炮制工艺。

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文章名称:Box-Behnken响应面法优化彝药蜜酒同制大黄工艺

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