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星点设计-效应面法优化紫杉醇-白桦脂酸混合纳米混悬剂

分类:(一) 发表时间:2019-08-25

近年来联合用药逐渐成为肿瘤治疗的研究热点, 联合用药可以通过发挥药物的协同抗肿瘤作用, 减小化疗药物毒性[1]。紫杉醇 (paclitaxel, PTX) 是从短叶红豆杉Taxus brevifolia Nutt.的树皮中分离
近年来联合用药逐渐成为肿瘤治疗的研究热点, 联合用药可以通过发挥药物的协同抗肿瘤作用, 减小化疗药物毒性[1]。紫杉醇 (paclitaxel, PTX) 是从短叶红豆杉Taxus brevifolia Nutt.的树皮中分离提取出的一种具有抗肿瘤活性的紫杉烷二萜化合物[2], 已在卵巢癌、乳腺癌、肺癌、白血病及胃肠道肿瘤的治疗上显示了明显的疗效[3,4,5,6,7,8], 但存在水溶解度小, 长期给药后会产生多药耐药现象[9], 采用混合有机溶剂助溶易导致临床出现严重不良反应等问题[10,11]。白桦脂酸 (betulinic acid, BA) 是一种五环三萜酸, 具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎等生物活性, 能通过诱导肿瘤细胞凋亡、阻碍细胞周期、抑制肿瘤细胞入侵和迁移、逆转多药耐药等多种机制对20多种肿瘤细胞有抑制作用[12,13,14]。另外文献报道, BA可与PTX协同诱导肿瘤细胞凋亡, 并逆转PTX多药耐药[15]。 PTX、BA水溶性均较差, 在水中溶解度分别为0.081μg/mL[10]和0.021μg/mL[16]。纳米混悬剂 (nanosuspension, NP) 是将药物颗粒制成纳米胶态分散体, 属于非载体给药系统, 与普通混悬剂相比具有许多优点:通过减小粒径, 能增加药物的饱和溶解度和溶出速率[17,18];固化后具有良好稳定性;制备工艺简单, 便于工业化大生产;辅料用量少;纳米混悬剂可以作为中间剂型, 用于其他剂型生产。纳米混悬剂适用于绝大部分难溶性药物, 可广泛用于口服、注射、眼部、肺部等多种给药途径[19]。此外将药物制备成纳米粒, 可以通过增强渗透和滞留 (EPR) 效应将药物粒子被动靶向于肿瘤部位[20], 提高药物在肿瘤部位蓄积[21,22], 增强抗肿瘤疗效。因此, 本实验采用高压均质机通过星点设计-效应面法优化纳米混悬剂制备工艺, 将PTX和BA制成纳米混悬剂来改善药物的溶解度, 提高溶出率, 为研发抗肿瘤复方新药提供帮助。 1 仪器与试药 APV-2000型高压均质机, 德国SPX Flow Technology公司;Labconco 6L型冻干机, 美国Labconco公司;3000SH型纳米粒度分析仪, 英国Malvern公司;Synthesis 108型超纯水仪, 美国Milli-Q公司;HY-45气浴恒温生物摇床, 江苏金坛市金城国盛实验仪器厂;XP/XS型微量分析天平, 瑞士Mettler Toledo公司;2695型高效液相色谱仪, 美国Waters公司;JEM-1200EX型透射电镜, 日本JEM公司;D/Max-2500PC型X-射线衍射仪, 日本Rigaku公司;C-204型差示扫描量热仪, 德国Netzsch公司。PTX原料药 (质量分数99%, 批号160608) 、BA原料药 (质量分数99%, 批号160703) , 南京清韵生物有限公司;PTX对照品 (质量分数98%, 批号Y03F6B1) 、BA对照品 (质量分数98%, 批号ZA08014SA13) 、卵磷脂 (批号T28M8F32477) , 上海源叶生物科技有限公司;泊洛沙姆188 (批号WPYI544B) , 德国BASF公司;聚山梨酯-80 (批号20170801) 、甘露醇 (批号F-20101026) , 国药集团化学试剂有限公司;甲醇, 色谱级, 江苏汉邦科技有限公司。 2 方法与结果 2.1 紫杉醇-白桦脂酸混合纳米混悬剂 (PTX-BA-NP) 的制备 称取质量浓度0.6 mg/mL的联合稳定剂 (8 mg泊洛沙姆188和4 mg卵磷脂) , 置去离子水20 mL中, 搅拌使其充分溶解, 得到稳定剂溶液。称取PTX粉末和BA粉末各40 mg, 溶于乙醇-醋酸乙酯 (1∶1) 混合溶液10 m L中, 超声使其充分溶解[23]。将含有药物的溶液缓慢滴加到稳定剂溶液中, 混合后继续800 r/min搅拌30 min, 减压挥去有机溶剂, 得初混悬液。将上述初混悬液加入到高压均质机中, 在100 MPa循环20次, 即得PTX-BA-NP。 2.2 单因素考察 本实验以纳米混悬剂的粒径和多分散系数 (polydispersity index, PDI) 为评价指标, 先对处方工艺进行单因素考察。 2.2.1 稳定剂种类考察 PTX-BA-NP后续给药途径为iv, 依据美国FDA非活性成分指南, 泊洛沙姆188、卵磷脂、聚山梨酯-80均可作为iv用辅料。因此, 本实验选用泊洛沙姆188、卵磷脂、聚山梨酯-80为稳定剂, 质量浓度0.6 mg/mL, 按照“2.1”项下方法制备PTX-BA-NP, 并测定粒径及PDI, 结果见表1。单独以卵磷脂为稳定剂时, PTX-BA-NP的PDI虽然小于0.3, 但粒径较大;单以泊洛沙姆188为稳定剂时, 纳米混悬剂的粒径小, 但PDI大于0.3;聚山梨酯-80作为iv用辅料存在安全隐患, 因此选择将泊洛沙姆188和卵磷脂联用作为PTX-BA-NP的稳定剂。 表1 稳定剂种类对PTX-BA-NP粒径和PDI的影响 (, n=3) Table 1 Effect of stabilizer type on particle size and PDI of PTX-BA-NP (, n=3) 下载原表 表1 稳定剂种类对PTX-BA-NP粒径和PDI的影响 (, n=3) Table 1 Effect of stabilizer type on particle size and PDI of PTX-BA-NP (, n=3) 2.2.2 联合稳定剂质量浓度的考察 泊洛沙姆188和卵磷脂比例固定为2∶1, 稳定剂质量浓度分别为0.3、0.6、0.9、1.2 mg/mL, 按照“2.1”项下方法制备PTX-BA-NP, 并测定粒径及PDI, 结果见表2。随着稳定剂质量浓度的增加, 纳米混悬剂的粒径和PDI呈先下降后上升趋势, 当稳定剂质量浓度为0.6mg/mL时, 粒径及PDI较佳。 表2 稳定剂质量浓度对PTX-BA-NP粒径和PDI的影响 (, n=3) Table 2 Effect of stabilizer concentration on particle size and PDI of PTX-BA-NP (, n=3) 下载原表 表2 稳定剂质量浓度对PTX-BA-NP粒径和PDI的影响 (, n=3) Table 2 Effect of stabilizer concentration on particle size and PDI of PTX-BA-NP (, n=3) 2.2.3 联合稳定剂比例考察 联合稳定剂总质量浓度固定为0.6 mg/mL, 泊洛沙姆188-卵磷脂比例分别为4∶1、2∶1、1∶1、1∶2, 按照“2.1”项下方法制备PTX-BA-NP, 并测定粒径及PDI, 结果见表3。随着卵磷脂比例的增加, PTX-BA-NP粒径降低。当两者比例达到2∶1时, 粒径显著降低, 继续增加卵磷脂, PTX-BA-NP的粒径和PDI无明显变化。 表3 稳定剂比例对PTX-BA-NP粒径和PDI的影响 (, n=3) Table 3 Effect of ratio of poloxamer 188 to lecithin on particle size and PDI of PTX-BA-NP (, n=3) 下载原表 表3 稳定剂比例对PTX-BA-NP粒径和PDI的影响 (, n=3) Table 3 Effect of ratio of poloxamer 188 to lecithin on particle size and PDI of PTX-BA-NP (, n=3) 2.2.4 均质压力考察 均质压力分别为30、50、80、100 MPa, 按照“2.1”项下方法制备PTX-BA-NP, 并测定剂粒径和PDI, 结果见表4。PTX-BA-NP的粒径随均质压力增大而减小。 2.2.5 均质循环次数 按照“2.1”项下方法, 分别均质5、10、15、20个循环, 制备PTX-BA-NP, 并测定剂粒径和PDI, 结果见表5。随着均质循环次数增加, PTX-BA-NP的粒径逐渐减小。 表4 均质压力对PTX-BA-NP粒径和PDI的影响 (, n=3) Table 4 Effect of pressure on particle size and PDI of PTX-BA-NP (, n=3) 下载原表 表4 均质压力对PTX-BA-NP粒径和PDI的影响 (, n=3) Table 4 Effect of pressure on particle size and PDI of PTX-BA-NP (, n=3) 表5 均质循环次数对PTX-BA-NP粒径和PDI的影响 (, n=3) Table 5 Effect of cycle times on particle size and PDI of PTX-BA-NP (, n=3) 下载原表 表5 均质循环次数对PTX-BA-NP粒径和PDI的影响 (, n=3) Table 5 Effect of cycle times on particle size and PDI of PTX-BA-NP (, n=3) 2.3 星点设计-效应面法优化处方 2.3.1 星点设计方案 在单因素实验基础上, 选择对PTX-BA-NP制备工艺影响显著的4个因素, 即稳定剂质量浓度 (A) 、泊洛沙姆188和卵磷脂的比例 (B) 、均质压力 (C) 及均质循环次数 (D) 为自变量, 以粒径大小 (Y1) 及PDI (Y2) 的综合评分[归一 (OD) 值]为评价指标[24,25,26], 进行工艺优化。因Y1及Y2属于取值越小越好的因素, 采用Hassan法先分对Y1、Y2进行标准化[27], 即计算dmin值[dmin= (Ymax-Yi) / (Ymax-Ymin) ], 再计算OD值[OD=dmin (Y1) ×权重 (Y1) +dmin (Y2) ×权重 (Y2) ], Y1权重、Y2权重均为0.5。根据OD值采用BoxBehnken中心组合设计优化, 各自变量的编码水平见表6, 不同制备工艺条件下粒径、PDI、OD值的相应变化见表6。响应面图见图1。 2.3.2 数学模型拟合及分析 采用Design-Expert V8.0.6软件进行数学模型拟合, 对所选的4个因素进行二次多项式方程拟合。OD=0.67+0.14 A+0.078 B+0.17 C+0.096 D+0.085 AB-0.038 AC+0.11 AD-0.051 BC+0.084 BD+2.608×10-3 CD-0.20 A2-0.030 B2-1.389×10-3 C2+0.018 D2, r2=0.821 0, P=0.003 7, 具有良好相关性。由表7方差分析数据可知, 拟合的2项多项式方程中A、C、D的一次项P值及A的2次项P值均小于0.05, 表明稳定剂质量浓度、均质压力、循环次数这3个因素对粒径及PDI影响较大, 尤其是均质压力。 表6 Box-Behnken试验设计方案及响应值Table 6 Design and response values of Box-Behnken test 下载原表 表6 Box-Behnken试验设计方案及响应值Table 6 Design and response values of Box-Behnken test 图1 各因素对OD影响的响应面图Fig.1 Response surface plots for various factors 图1 各因素对OD影响的响应面图Fig.1 Response surface plots for various factors 下载原图 表7 方差分析Table 7 Analysis of variance 下载原表 表7 方差分析Table 7 Analysis of variance 2.3.3 响应面优化 采用Design-Expert V8.0.6软件对处方进行优化, 软件给出的理论最佳处方工艺条件为稳定剂质量浓度0.8 mg/mL, 泊洛沙姆188-卵磷脂比2∶1, 均质压力100 MPa, 均质循环次数20次。因稳定剂质量浓度为0.6、0.8 mg/mL时, 混合纳米混悬剂粒径及PDI差不多, 依据辅料最少原则, 将最佳处方工艺修正为稳定剂质量浓度0.6mg/mL, 泊洛沙姆188-卵磷脂比2∶1, 均质压力100 MPa, 均质循环次数20次。 2.3.4 工艺验证 根据优化后的处方工艺制备3批纳米混悬剂, 平均粒径为 (282.54±5.40) nm, PDI为0.242±0.020, 平均OD值为0.940, 与预测值1.03接近, 表明该模型预测性良好, 可信度高, 可用于处方优化。 2.4 冷冻干燥 本实验采用冷冻干燥法固化优化的纳米混悬液, 并考察不同冻干保护剂及其用量对于PTX-BA-NP冻干前后粒径和PDI的影响, 见表8。结果表明, 当以5%甘露醇作为冻干保护剂时, PTX-BA-NP冻干粉的再分散性 (redispersibility index, RDI) 最小, 为103.3%, 冻干保护效果最好。故冷冻干燥工艺为向优化的纳米混悬液中加入5%甘露醇, 置-80℃冰箱中预冻24 h后放入冷冻干燥机中, -30℃维持36 h, -10℃维持24 h, 0℃维持2 h, 25℃维持2 h, 即得冻干粉。 表8 PTX-BA-NP冻干前、后粒径和PDI (n=3) Table 8 Particle size and PDI of PTX-BA-NP before and after freezing (n=3) 下载原表 表8 PTX-BA-NP冻干前、后粒径和PDI (n=3) Table 8 Particle size and PDI of PTX-BA-NP before and after freezing (n=3) 2.5 PTX-BA-NP的表征 2.5.1 RDI评价 RDI即冻干后与冻干前纳米粒的粒径之比, 是用来评价冻干粉分散程度的指标[21]。取“2.4”项下制得的冻干粉适量, 加纯水超声1 min左右, 复溶至同原纳米混悬液相同浓度, 平行3份, 测定粒径及PDI。结果表明, 冻干粉复溶后粒径为 (291.6±3.4) nm, PDI为0.182±0.030, 与“2.4”项下冷冻干前粒径比较, RDI值为103.3%, 表明再分散后仍能保持原有的混悬状态。再分散前后粒径分布图见图2。 2.5.2 外观形态 采用透射电镜 (TEM) 观察PTX-BA-NP的形态。将1滴纳米混悬液滴在铜网上, 用2%磷钨酸染色5 min。室温下将铜网晾干, 放置透射电镜下观察, 结果见图3。由图3可知, PTX-BA-NP粒径为260~300 nm, 粒子呈现棒状, 大小分布均匀, 粒子之间的黏连和聚集现象较少。 图2 PTX-BA-NP冻干前 (A) 和冻干后 (B) 粒度分布Fig.2 Particle size distribution of PTX-BA-NP before lyophilization (A) and after lyophilization (B) 图2 PTX-BA-NP冻干前 (A) 和冻干后 (B) 粒度分布Fig.2 Particle size distribution of PTX-BA-NP before lyophilization (A) and after lyophilization (B) 下载原图 图3 透射电镜照片 (×50 000) Fig.3 TEM image (×50 000) 图3 透射电镜照片 (×50 000) Fig.3 TEM image (×50 000) 下载原图 2.5.3 稳定性考察 将冷冻干燥后的药物存储至恒温恒湿箱中, 在40℃和75%的相对湿度下储存1个月, 分别于第1、10、20、30天复溶测定粒径及PDI, 观察粒径及PDI变化。见表9。 2.5.4 差示扫描量热分析 将PTX原料药、BA原料药、泊洛沙姆188、卵磷脂、甘露醇、PTX-BA-辅料-物理混合物 (PTX、BA、泊洛沙姆188、卵磷脂及甘露醇的比例同PTX-BA-NP冻干粉) 及PTX-BA-NP冻干粉进行差示扫描量热分析。测定参数:升温速率为10℃/min, 升温范围为35~280℃, 空铝盘作为空白对照, 测定载气为氮气, 见图4。由图4可知, PTX原料药在225℃存在熔融峰, 在245℃存在重结晶峰, 表明PTX原料药以晶体形式存在;BA原料药在35~280℃不存在熔融峰;甘露醇及泊洛沙姆188分别在175℃和57.1℃存在熔融峰, 表明其以晶体形式存在;卵磷脂不存在熔融峰;PTX-BA-辅料-物理混合物中PTX在220℃附近存在较小的熔融峰, 在240℃附近存在较小重结晶峰, 表明PTX-BA-辅料-物理混合物中PTX是以晶体形式存在;PTX-BA-NP冻干粉在173.5℃存在较大吸收峰, 在63.3℃存在微弱吸收峰, 分别为甘露醇及泊洛沙姆188的熔融峰, 不存在PTX的熔融峰与重结晶峰, 分析原因可能为PTX与BA制备成纳米混悬剂后, PTX由晶体形式变为无定形状态。DSC分析初步显示PTX-BA NP中的PTX、BA以无定形形式存在, 但DSC对晶型判断提供的信息有限, 因此还需依据X射线衍射数据进行进一步分析。 表9 稳定性实验结果 (n=3) Table 9 Short time stability study (n=3) 下载原表 表9 稳定性实验结果 (n=3) Table 9 Short time stability study (n=3) 图4 差示扫描量热图Fig.4 Differential scanning calorimetry 图4 差示扫描量热图Fig.4 Differential scanning calorimetry 下载原图 2.5.5 X-射线衍射分析 将“2.5.4”项下的各样品分别填塞在样品皿中, 使用Ni-滤波器、Cu靶Kα射线、电压40 kV和电流100 mA的条件, 在5°~50°内以每步0.02°进行扫描, 见图5。PTX在5.51°、8.87°、10.01°、12.22°有衍射峰, 说明其是晶体结构;BA在5.55°、9.07°、13.00°、13.33°、14.24°、15.11°、18.77°有衍射峰, 说明其是晶体结构;在物理混合物中, BA及PTX晶体特征仍存在, 但在纳米混悬剂中, PTX及BA晶体衍射峰消失, 均以无定形状态存在, 分析原因为PTX与BA在制备成纳米混悬剂后, 均由晶体形态变为无定形状态。X-衍射分析结果进一步验证了DSC结果。 2.6 溶解度及体外溶出 2.6.1 对照品溶液制备 图5 X-射线衍射Fig.5 X-ray diffraction patterns 图5 X-射线衍射Fig.5 X-ray diffraction patterns 下载原图 精密称取PTX对照品2mg, BA对照品1.34 mg, 加甲醇溶解, 并定容至10 mL量瓶中, 混匀, 即得PTX与BA的混合对照品储备液。 2.6.2 色谱条件及系统适应性条件 采用Kromasil C18色谱柱 (250 mm×4.6 mm, 5μm) ;流动相为甲醇-0.1%甲酸水溶液 (75∶25) ;体积流量1.0m L/min, 检测波长227 nm (PTX) , 201 nm (BA) ;柱温35℃;进样量10μL;理论塔板数以PTX峰计算不低于4 000。 2.6.3 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液适量, 按比例将其稀释成一定的倍数, 精密吸取上述浓度梯度溶液各10μL, 注入液相色谱仪, 记录PTX及BA峰面积积分值, 分别以质量浓度为横坐标 (X) , 其峰面积积分值为纵坐标 (Y) , 绘制PTX与BA的标准曲线。结果显示, PTX在3.273~209.5μg/mL线性关系良好, 线性回归方程为Y=20 494X-762, r2=0.999 9;BA在2.122~135.8μg/mL线性关系良好, 线性回归方程为Y=5 125.8 X+1 274, r2=0.998 1。 2.6.4 精密度实验 取一定质量浓度的混合对照品溶液, 连续进样6次, 记录PTX和BA峰面积, 计算精密度, RSD分别为0.39%和1.04%。 2.6.5 重复性实验 取同一批冻干粉, 用适量甲醇溶解, 平行制备6份供试品溶液, 进样10μL, 记录PTX和BA的峰面积, 计算二者质量分数, 其RSD分别为0.26%和1.51%。 2.6.6 稳定性实验 取制备所得的供试品溶液分别于0、2、4、8、12 h进样, 记录PTX和BA峰面积, 计算含量, 其RSD为0.65%和1.43%。 2.6.7 溶解度 将过量PTX原料药、BA原料药、PTX-BA-NP分别加至纯水中, 室温 (25℃) 下以100 r/min的频率连续振摇。为避免稳定剂对PTX和BA增溶作用的影响, 另设配以与纳米冻干粉相同种类及稳定剂比例的PTX-BA原料组, PTX和BA质量比为1∶1。同法操作。平衡72 h后, 取各饱和溶液3 mL, 取上清液过0.45μm微孔滤膜, 吸取续滤液, 按照“2.6.2”项下色谱条件进样测定, 记录峰面积, 计算饱和溶解度。 由表10中数据可知, PTX和BA原料药饱和溶解度均较低, 加入一定的辅料后, PTX溶解度增加约5倍, BA溶解度增加约7倍, 辅料的增溶作用有限。PTX和BA制备成纳米冻干粉后, 水中溶解度显著提高, 纳米制剂中PTX溶解度提高约90倍, BA溶解度提高约100倍。 表1 0 溶解度测试结果 (n=3) Table 10 Results of solubility test (n=3) 下载原表 表1 0 溶解度测试结果 (n=3) Table 10 Results of solubility test (n=3) 2.6.8 体外溶出 精密称取PTX原料药、BA原料药、PTX-BA-NP冻干粉 (相当于PTX 15 mg) , 按《中国药典》2015年版附录四部通则0931第二法有关规定进行测定。溶出介质为含0.1%聚山梨酯-80的pH 7.4磷酸缓冲液 (0.05 mol/L, 200 mL) , 温度为 (37.0±0.5) ℃, 转速为75 r/min。分别于5、10、15、30、60、120 min时取样1 mL (随即补足同温等量的溶出介质) , 14 000 r/min离心10 min, 取上清液照“2.6.2”项下色谱条件进行测定, 分别计算不同时间的累积溶出率, 绘制溶出曲线, 结果见图6。与PTX及BA原料对比, PTX-BA纳米混悬剂累积溶出率明显提高。在2 h内, PTX-BA纳米混悬剂中PTX和BA累积溶出率大于95%, 而PTX及BA原料药累积溶出率均小于20%。 3 讨论 为了制备稳定的纳米混悬剂, 克服纳米粒子间的相互吸引及减少粒子之间相互碰撞机会, 通常使用适量的稳定剂来抑制纳米粒子的成长[28,29], 因此筛选合适的稳定剂至关重要。稳定剂分为非离子型表面活性剂 (如聚山梨酯-80、泊洛沙姆P188、泊洛沙姆P407) 和两亲性表面活性剂 (如卵磷脂) 。非离子型表面活性剂主要通过空间位阻效应防止纳米粒聚集沉降, 离子型表面活性剂主要以静电斥力阻碍纳米粒子聚集沉降[30]。实验中将泊洛沙姆P188与卵磷脂联用, 卵磷脂可吸附于纳米混悬剂表面, 为纳米粒子提供电荷, 使纳米粒子之间由于电荷斥力而维持稳定;泊洛沙姆P188在纳米粒子表面吸附, 其高分子链具有一定的舒展性, 可在空间上阻碍纳米粒子间彼此靠近, 两种稳定剂共同维持纳米混悬剂的稳定。 图6 PTX (A) 和BA (B) 的体外溶出曲线 (n=3) Fig.6 Dissolution curves of PTX (A) and BA (B) in vitro (n=3) 图6 PTX (A) 和BA (B) 的体外溶出曲线 (n=3) Fig.6 Dissolution curves of PTX (A) and BA (B) in vitro (n=3) 下载原图 依据Ostwald-Freundlich方程, 粒径减小至微米甚至纳米级时, 由于粒径小、比表面积大, 药物的饱和溶解度与溶出速率均会显著增大[17]。本研究得到的PTX-BA-NP, 粒径较小, 均一稳定, 冷冻干燥后再复溶性良好。PTX和BA制备成纳米混悬剂后, 其饱和溶解度明显增大, 从而体外溶出速率提高, 在2 h内, PTX和BA累积溶出率分别为PTX原料药和BA原料药中的6.13和4.18倍, 表明纳米混悬剂可以显著改善PTX及BA体外溶出速率。

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